ข้อมูล

การใช้เงื่อนไข: Enhancer, ลำดับการเปิดใช้งานต้นน้ำและลำดับการเปิดใช้งาน Downstream


จากวิกิพีเดีย

หนึ่ง ลำดับการเปิดใช้งานต้นน้ำ หรือลำดับการเปิดใช้งานต้นน้ำ (UAS) เป็นลำดับการกำกับดูแลที่ทำหน้าที่ cis มันแตกต่างจากโปรโมเตอร์และเพิ่มการแสดงออกของยีนข้างเคียง

อีกครั้ง,

ในพันธุกรรม an สารเพิ่มประสิทธิภาพ เป็นขอบเขตของ DNA สั้น (50-1500 bp) ที่สามารถจับกับโปรตีน (ตัวกระตุ้น) เพื่อเพิ่มโอกาสที่การถอดรหัสของยีนหนึ่งๆ จะเกิดขึ้น

ฉันไม่พบความแตกต่างระหว่างพวกเขา พวกเขามีความหมายเหมือนกันหรือไม่

เนื่องจากมีบทบาทสำคัญในการกระตุ้นการถอดรหัส ลำดับการกระตุ้นต้นน้ำจึงมักถูกพิจารณาว่าคล้ายคลึงกับหน้าที่ของเอนแฮนเซอร์ในยูคาริโอตหลายเซลล์

ดูเหมือนว่าจะมีลำดับการกำกับดูแลอีกประเภทหนึ่ง ซึ่งเป็นองค์ประกอบการเปิดใช้งานดาวน์สตรีม ฉันคิดว่ามันเป็นคำพ้องความหมายอีกคำหนึ่งสำหรับเอนแฮนเซอร์ที่อยู่ปลายน้ำที่ไซต์เริ่มต้นการถอดความ


โปรตีนที่จับกับยีสต์ rDNA Enhancer

การถอดรหัสยีนไรโบโซมอาร์เอ็นเอแตกต่างจากยีนอื่นๆ ในหลายประการ: การใช้โพลีเมอเรสเฉพาะทาง การถอดความในระดับสูงโดยทั่วไป และการจัดเรียงยีนควบคู่กัน ในยีสต์ Saccharomyces cerevisiaeเราระบุลำดับนิวคลีโอไทด์ในบริเวณเว้นวรรคที่ “ไม่ถูกถอดรหัส” ที่มีคุณลักษณะหลายอย่างของเอนแฮนเซอร์ของการถอดรหัส (8) เมื่อเร็วๆ นี้ เห็นได้ชัดว่าการถอดรหัสลำดับนี้เกิดขึ้น (9) และอาจเกี่ยวข้องกับการยุติการถอดรหัส 35 S rRNA ในบางลักษณะด้วย ความเป็นไปได้ที่จะมีปัจจัยโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการยุติและการกระตุ้นการถอดรหัส และสิ่งเหล่านี้อาจมีส่วนร่วมในการมีเพศสัมพันธ์ของการถอดรหัสของยีน rRNA ที่อยู่ติดกันทำให้เราค้นหาโปรตีนที่อาจจับกับเอนแฮนเซอร์ เราได้ระบุโปรตีนดังกล่าวสองชนิด เรียกว่า REB1 และ REB2 ซึ่งจับกับเอนแฮนเซอร์และปกป้องลำดับเฉพาะจากการจู่โจมโดยสารเคมีและรีเอเจนต์ของเอนไซม์ เป็นที่น่าสังเกตว่ามีไซต์ที่มีผลผูกพัน REB1 แห่งที่สองประมาณ 210 คู่เบสที่ต้นทางของต้นกำเนิดของการถอดรหัส rRNA และการผูกมัดของ REB1 กับไซต์นี้จะเปลี่ยนโครงสร้างของดีเอ็นเอที่อยู่ติดกับไซต์ของการเริ่มต้น


ตัวเลือกการเข้าถึง

เข้าถึงวารสารฉบับเต็มเป็นเวลา 1 ปี

ราคาทั้งหมดเป็นราคาสุทธิ
ภาษีมูลค่าเพิ่มจะถูกเพิ่มในภายหลังในการชำระเงิน
การคำนวณภาษีจะสิ้นสุดในขั้นตอนการชำระเงิน

รับสิทธิ์เข้าถึงบทความแบบจำกัดเวลาหรือแบบเต็มบน ReadCube

ราคาทั้งหมดเป็นราคาสุทธิ


ตัวเพิ่มประสิทธิภาพและการถอดความ

ในยีนยูคาริโอตบางชนิด มีบริเวณที่ช่วยเพิ่มหรือปรับปรุงการถอดรหัส บริเวณเหล่านี้เรียกว่า เอนแฮนเซอร์ ไม่จำเป็นต้องอยู่ใกล้กับยีนที่พวกมันปรับปรุง พวกมันสามารถพบได้ที่ต้นน้ำของยีน ภายในขอบเขตการเข้ารหัสของยีน ปลายน้ำของยีน หรืออาจอยู่ห่างออกไปหลายพันนิวคลีโอไทด์

บริเวณสารเพิ่มประสิทธิภาพคือลำดับการผูก หรือไซต์ สำหรับปัจจัยการถอดรหัส เมื่อโปรตีนดัดดีเอ็นเอจับกัน รูปร่างของดีเอ็นเอจะเปลี่ยนไป (รูปที่ (PageIndex<1>)) การเปลี่ยนแปลงรูปร่างนี้อนุญาตให้มีปฏิสัมพันธ์ของตัวกระตุ้นที่จับกับเอนแฮนเซอร์ด้วยปัจจัยการถอดรหัสที่ผูกกับบริเวณโปรโมเตอร์และ RNA polymerase ในขณะที่โดยทั่วไปแล้ว DNA ถูกวาดเป็นเส้นตรงในสองมิติ แต่จริงๆ แล้วมันเป็นวัตถุสามมิติ ดังนั้น ลำดับนิวคลีโอไทด์ที่อยู่ห่างออกไปหลายพันนิวคลีโอไทด์สามารถพับและโต้ตอบกับโปรโมเตอร์จำเพาะได้


การอภิปราย

ลำดับโปรโมเตอร์ที่เรากำหนดรวมถึงส่วนสำคัญของยีน SCBV ORF III ลำดับ SCBV839 ซึ่งมีฤทธิ์มากที่สุดในการสอบวิเคราะห์แบบชั่วคราว ทับซ้อนกับ 525 โปรตีนซึ่งกำหนดรหัสนิวคลีโอไทด์ ลำดับที่ทับซ้อนกันยีน ORF III ประกอบด้วยกิจกรรมโปรโมเตอร์ส่วนใหญ่ตามที่แสดงให้เห็นโดยชิ้นส่วน SCBV333 ที่มีเพียง 20 bp ของยีน ORF III และมีเพียง 10% ของกิจกรรมโปรโมเตอร์ของลำดับ SCBV839 (รูปที่ 3) แฟรกเมนต์เอนแฮนเซอร์ SCBV282 มีลำดับการเข้ารหัส ORF III 189 bp สถานการณ์ที่คล้ายคลึงกันนี้พบได้ใน Arabidopsis ซึ่งองค์ประกอบด้านกฎระเบียบสำหรับโปรโมเตอร์ของ ซวิเชล (ZWI) พบยีนในลำดับเอ็กซอนและอินตรอนที่อยู่ติดกัน HYDROXYISOBUTYRL-CoA HYDROLASE 1 (CHY1) ยีน [49].

ลำดับเอนแฮนเซอร์ในโปรโมเตอร์ SCBV-IM สามารถเพิ่มการออกฤทธิ์ของโปรโมเตอร์ ZmADH1 ที่ถูกตัดปลาย (รูปที่ 4) แต่โปรโมเตอร์แบบคิเมริกเหล่านี้อ่อนแอกว่าโปรโมเตอร์ SCBV-IM ที่ยังไม่เสียหายมากในการสอบวิเคราะห์แบบชั่วคราว (รูปที่ 3) ความแตกต่างนี้ยิ่งใหญ่มากจนไม่น่าจะเป็นผลมาจากการเตรียมเซลล์ที่แตกต่างกัน และอาจเป็นผลมาจากลำดับการเปิดใช้งานต้นน้ำ SCBV-IM ที่มีปฏิสัมพันธ์อย่างแตกต่างกับโปรโมเตอร์ ZmADH1 แกนที่แตกต่างกันและโปรโมเตอร์ SCBV-IM ดั้งเดิม ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันเกิดขึ้นเมื่อวางเอนแฮนเซอร์ CaMV 35S ที่ต้นน้ำของโปรโมเตอร์หลัก CaMV 19S [38]

การวิเคราะห์การลบโปรโมเตอร์ SCBV-IM แสดงให้เห็นว่าการลบลำดับจาก −770 ถึง −507 ทำให้กิจกรรมโปรโมเตอร์ลดลง 30% ในขณะที่การลบลำดับจาก −770 ถึง −264 ทำให้กิจกรรมลดลง 90% (รูปที่ 3) ดังนั้นจึงค่อนข้างน่าแปลกใจที่สังเกตเห็นว่าตัวก่อกวนคิเมริก SCBV537::ZmADH1 (ที่มีลำดับ SCBV-IM −689 ถึง -153) มีกิจกรรมน้อยกว่าตัวก่อกวนคิเมริก SCBV282::ZmADH1 (ที่มีลำดับ SCBV-IM −434 ถึง - 153) เนื่องจากส่วนที่ยาวกว่าในการวิเคราะห์การลบโปรโมเตอร์มีกิจกรรมมากที่สุด ผลลัพธ์ที่น่าแปลกใจมักจะได้รับเมื่อมีการเพิ่มหรือลบบางส่วนของโปรโมเตอร์และแม้แต่โปรโมเตอร์ส่วนเล็ก ๆ ก็สามารถมีผลกระทบอย่างมาก ตัวอย่างเช่น Dey และ Matti [15] แสดงให้เห็นว่าการลบ 50 bp ของโปรโมเตอร์ MMV เพิ่มกิจกรรม 10 เท่าและ Simon et al [50] แสดงให้เห็นว่าการลบ 54 bp ของ ภายในไม่มีภายนอก โปรโมเตอร์ของ Arabidopsis สามารถย้อนกลับโปรโมเตอร์ที่เงียบได้

สำเนาหลายชุดของเอนแฮนเซอร์ SCBV-IM ทำให้กิจกรรมของไคเมอริกโปรโมเตอร์เพิ่มขึ้นในการสอบวิเคราะห์แบบชั่วคราว (รูปที่ 5) สิ่งนี้สอดคล้องกับสิ่งที่สังเกตได้จากตัวเร่งปฏิกิริยา CaMV 35S และ FMV [8], [37] - [39] และอาจเนื่องมาจากสำเนาของเอนแฮนเซอร์หลายชุดมีประสิทธิภาพมากขึ้นในการสรรหาปัจจัยการถอดรหัสให้กับโปรโมเตอร์

ชิ้นส่วน SCBV282 สามารถทำหน้าที่เป็นตัวเพิ่มการถอดรหัสเมื่อมีอยู่ในจีโนมข้าวโพดในอาร์เรย์ที่เรียงตามกัน 4x ในเหตุการณ์ที่มีเอนแฮนเซอร์ SCBV-IM 4x ที่ต้นน้ำและปลายน้ำของยีน และในทิศทางใดทิศทางหนึ่งที่สัมพันธ์กับยีนเหล่านี้ จะสังเกตพบการสะสมของทรานสคริปต์ที่เพิ่มขึ้น (รูปที่ 7) นอกจากนี้ ดูเหมือนว่าองค์ประกอบจะทำให้เกิดการสะสมของข้อความถอดเสียงที่ไม่มีอยู่หรือมีอยู่ในระดับที่ต่ำมากในสายที่ไม่ดัดแปลงพันธุกรรม นี่แสดงให้เห็นว่าอาจใช้เอนแฮนเซอร์ SCBV-IM สำหรับการเปิดใช้งานการติดแท็กในข้าวโพด เอนแฮนเซอร์ SCBV-IM เพิ่มการแสดงออกของ 2 ใน 8 ยีนที่แสดงการแสดงออกที่ตรวจไม่พบในพืชควบคุมที่ไม่ผ่านการดัดแปลงพันธุกรรม นี่เป็นการศึกษาที่คล้ายกันบางชิ้นที่รายงานการแสดงออกของยีนนอกมดลูกเมื่อสารเสริม CaMV 35S รวมอยู่ใกล้เคียง [51], [52]


วัสดุและวิธีการ

เซลล์ P2C2 (SCID.adh2C2), 32D และ Raw264.7 ถูกเพาะเลี้ยงและทรานส์เฟกด้วยชุดของ Bcl11b-โครงสร้างนักข่าวลูซิเฟอเรสที่เชื่อมโยงลำดับและโปรตีนเรืองแสงสีเหลือง (mCitrine, YFP) ตามที่บรรยายไว้ในที่นี้ 17,18 DNA methylation ถูกวัดโดยการหาลำดับไบซัลไฟต์-DNA การกลายพันธุ์ของเมเจอร์พีค (MP) ถูกสร้างขึ้นโดยฟิวชัน PCR กับไพรเมอร์ที่แสดงไว้ในตารางเสริมที่ 1 (มีอยู่ใน เลือด เว็บไซต์) อันตรกิริยาของ DNA ระยะไกลถูกวัดโดยการทดสอบการจับโครงสร้างด้วยโครมาติน ผู้รายงานโครโมโซมเทียมแบคทีเรีย (BAC) 19,20 คนถูกสร้างขึ้นโดยการรวมตัวใหม่ 21,22 หมายเลขภาคยานุวัติสำหรับข้อมูล TCF-1 ChIP-seq: GSE46662 วิธีการโดยละเอียดมีอยู่ในวัสดุและวิธีการเพิ่มเติม ในรูปหนึ่ง เซลล์ถูกใช้จากต่อมไทมัสและม้ามของเมาส์ สัตว์เหล่านี้ได้รับการอบรมและบำรุงรักษาในอาณานิคมของเราที่ Caltech และถูกนำมาใช้ทั้งหมดตามระเบียบการอนุมัติของคณะกรรมการการดูแลสัตว์และการใช้ของสถาบัน


ผลลัพธ์

จุดเด่นของสารเพิ่มประสิทธิภาพ pol II คือสามารถมีอิทธิพลต่อการแสดงออกของยีนจากตำแหน่งที่ห่างไกล ในทางตรงกันข้าม ลำดับการควบคุมของยีนที่คัดลอกโดย RNA polymerase III (pol III) มักจะอยู่ใกล้กับยีน และไม่สามารถทำงานได้ในระยะทางไกล (25) ตามข้อสังเกตนี้ การศึกษาของเราเกี่ยวกับกฎระเบียบของ UAS NS - SNR6 , ยีนของยีสต์ pol III ที่ถูกกระตุ้นโดยการปล่อยสัญญาณไปยังหน่วยย่อย TFIIIC τ138 กับ UAS NS ลำดับผ่านการหลอมรวมกับโดเมนการจับ DNA ของ Gal4p (DBD) ( 26 , 27 ) บ่งชี้ว่าการแยก UAS นี้ NS - SNR6 ยีนเช่นเพื่อเปลี่ยน UAS NS องค์ประกอบไปยังตำแหน่งที่ห่างไกลมากขึ้นจะลดการแสดงออกของมันลงอย่างมาก (ดูด้านล่าง) ความแตกต่างในการทำงานดังกล่าวระหว่างลำดับระเบียบข้อบังคับของ pol II และ pol III เป็นพื้นฐานสำหรับระบบที่เราสร้างขึ้นเพื่อตรวจสอบโหมดของกิจกรรมการเพิ่มประสิทธิภาพ ในร่างกาย . สำหรับระบบนี้ เราพิจารณาความเป็นไปได้ที่กลไกการออกฤทธิ์ของเอนแฮนเซอร์ pol II (อะไรก็ตาม นั่นคือ การสแกน การเชื่อมโยง หรือการวนซ้ำ) ที่อยู่ถัดจากองค์ประกอบควบคุม pol III เทียมที่เคลื่อนอาจช่วยฟื้นฟูการสื่อสารระหว่างองค์ประกอบนี้ (UAS) NS ) และผู้ก่อการ pol III และอนุญาตให้เปิดใช้งาน SNR6 ยีน pol III ในระยะไกล รูปที่ 1 แผนผังแสดงพื้นฐานระดับโมเลกุลของระบบนี้ NS SNR6 ยีนและ a lacZ ยีนนักข่าวที่คัดลอกมาจากโปรโมเตอร์ pol II ถูกผูกไว้ในทิศทางที่แตกต่างกัน ปลายน้ำของ SNR6 เราวางตำแหน่งไซต์ที่มีผลผูกพัน Gal4p ห้าแห่ง (UAS NS ) และที่อยู่ติดกันสี่ตำแหน่ง (BS) สำหรับ LexA ในฐานะเอนแฮนเซอร์ pol II โปรตีนชนิดคิเมริกซึ่งมีโดเมนการกระตุ้นของ Gal4p ที่หลอมรวมกับ LexA (Lex-AD) ถูกใช้เป็นตัวกระตุ้นจำเพาะ pol II เพื่อเลียนแบบสถาปัตยกรรมโปรโมเตอร์ของ metazoans ให้ละเอียดยิ่งขึ้น ไซต์ที่มีผลผูกพัน LexA เดียวถูกแทรกใกล้กับ GAL1 กล่อง TATA เพื่ออำนวยความสะดวกในการดำเนินการของตัวเสริมระยะไกล ( 7 ) ( รูปที่ 1 ) โครงสร้างตัวรายงาน pol II–pol III นี้ถูกรวมเข้ากับจีโนมของสายพันธุ์ยีสต์ที่มีการลบล้างจากภายนอก SNR6 ยีน. เนื่องจากการน็อคเอาท์นี้ทำให้ถึงตาย เราจึงจัดเตรียมอุปกรณ์ที่ใช้งานได้จริง SNR6 อัลลีลที่มีการลบ 6 bp ( SNR6-6 ) บนพลาสมิด episomal ที่มีเครื่องหมาย URA3 ยีนที่เสริมการพร่องของ U6 snRNA ชนิด wild-type ภายในอย่างสมบูรณ์ และไม่ได้รับผลกระทบจาก Gal4DBD-τ138 ยีนเครื่องหมายนี้ช่วยให้เราสามารถติดตามการแสดงออกของ UAS NS - SNR6 ยีนนักข่าวโดยการเลือกการสูญเสียของ SNR6-6 พลาสมิด episomal ต่อการเติบโตของเซลล์บนตัวกลาง 5-FOA (26, 28) ประสิทธิภาพของการเจริญเติบโตของเซลล์ในตัวกลางที่เลือกนี้มีความสัมพันธ์กับระดับการแสดงออกของ UAS NS - SNR6 ยีน ( 26 ) (ดูด้านล่าง) นอกจากนี้ ผลิตภัณฑ์ U6 snRNA ที่สั้นกว่าของ SNR6-6 อัลลีลที่ดำเนินการโดย URA3 - พลาสมิดที่มีเครื่องหมาย centromeric ช่วยให้ตรวจสอบการแสดงออกของทั้งสอง SNR6 อัลลีลในการทดสอบไพรเมอร์ส่วนขยายเดียวตั้งแต่ SNR6-6 แยกแยะได้ง่ายจากผลิตภัณฑ์ของ SNR6 ยีนนักข่าวโดยเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส ในการตั้งค่าการทดลองของเรา โมเดลทั้งสามที่อธิบายข้างต้นทำการคาดการณ์ที่แตกต่างกันของข้อกำหนดสำหรับการเปิดใช้งาน UAS แยกใหม่ NS - SNR6 ยีนนักข่าว pol III โดยตัวเสริม pol II การคาดการณ์เหล่านี้ได้รับการทดสอบแล้ว (ดูด้านล่าง)

สายพันธุ์ของยีสต์ที่มีโครงสร้างนักข่าวแสดงไว้ในรูปที่ 1 ถูกแปลงสภาพด้วยพลาสมิดที่แสดงปัจจัยการถอดรหัส pol II และ pol III ที่ระบุในรูปที่ 2 การเปิดใช้งานของ SNR6 ยีนของนักข่าวได้รับการตรวจสอบโดยการระบุส่วนย่อยของวัฒนธรรมยีสต์เหล่านี้บนเพลตที่อนุญาต (−Leu −Trp SD) และเพลตที่ไม่อนุญาต (−Leu −Trp SD + 5-FOA) เพื่อเลือกเซลล์ที่อาจสูญเสียเอพิโซม สำเนา SNR6 . การแสดงออกของปัจจัยการถอดรหัส pol III τ138 ที่ไม่มีมอยอิตี Gal4p DBD ไม่ทำให้เกิดการเปิดใช้งาน UAS อย่างใดอย่างหนึ่ง NS - SNR6 ( รูปที่ 2A ) หรือของ lacZ ( รูปที่ 2B ) ยีนของนักข่าว การแสดงออกของตัวกระตุ้นการถอดรหัส pol II Lex-AD เปิดใช้งานอย่างมาก lacZ การแสดงออกของยีน ( รูปที่ 2B ) แต่ไม่ได้กระตุ้นการแสดงออกของ UAS NS - SNR6 ยีน ( รูปที่ 2A ). การแสดงออกของโปรตีนหลอมรวม Gal4DBD-τ138 เปิดใช้งานการถอดรหัส UAS NS - SNR6 ยีน ( รูปที่ 2A ) แต่ไม่ใช่ของ lacZ ยีนนักข่าว ( รูปที่ 2B ) การรวม pol II (Lex-AD) และ pol III (Gal4DBD-τ138) activators มีผลกระทบด้านลบเล็กน้อย แต่ทำซ้ำได้ต่อกิจกรรมของพวกเขา อย่างไรก็ตาม พวกมันสามารถกระตุ้นการแสดงออกของยีนของนักข่าวที่เกี่ยวข้องได้เมื่อปรากฏพร้อมกันบน DNA ของนักข่าว (รูปที่ 2A และ B) ในการทดลองควบคุม เราเฝ้าติดตามการเจริญเติบโตบนเพลต 5-FOA ของสายพันธุ์ไอโซเจนิกที่มีโครงสร้างนักข่าวที่ไม่มี UAS NS - SNR6 ยีน แต่มีลำดับอื่น ๆ ทั้งหมดที่อธิบายไว้ข้างต้น รูปที่ 2C แสดงว่าไม่มีปัจจัยการถอดรหัสที่แสดงออกใดๆ ที่กระตุ้นการเติบโตของยีสต์สายพันธุ์นี้บนจานที่มี 5-FOA ซึ่งบ่งชี้ว่าการเติบโตแบบเลือกเฟ้นของเซลล์ที่มีโครงสร้างตัวรายงานที่สมบูรณ์เป็นผลโดยตรงจากการกระตุ้นของผู้รายงาน SNR6 ยีน. ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่ายีนที่แยกจากกันนั้นทำงานได้ แม้ว่าโพลีเมอร์ทั้งสองจะถูกกระตุ้น และตัวกระตุ้น pol II ไม่ได้ส่งอิทธิพลโดยตรงต่อการแสดงออกของยีนของยีนนักข่าว pol III และในทางกลับกัน

ระยะห่างระหว่าง UAS ที่จับกับ Gal4DBD-τ138 NS องค์ประกอบและ SNR6 ยีนบนโครงสร้างตัวรายงานพื้นฐาน ( รูปที่ 1 ) เพิ่มขึ้นในลักษณะเป็นขั้นตอนโดยแนะนำชิ้นส่วนดีเอ็นเอ 100, 200 หรือ 400 bp ระหว่างสองลำดับนี้ ( รูปที่ 3A ) จากนั้นเราทดสอบระดับของ SNR6 และการเปิดใช้งานการถอดรหัสβ-galactosidase ของโครงสร้างนักข่าว pol III เหล่านี้ต่อหน้า Gal4DBD-τ138, Lex-AD หรือการรวมกันของ Gal4DBD-τ138 และ Lex-AD และเปรียบเทียบกับระดับการเปิดใช้งานของ UAS ที่ไม่ใช้ตัวเว้นวรรค NS - SNR6 . การเพิ่มระยะห่างระหว่าง UAS . แบบเป็นขั้นตอน NS องค์ประกอบและ SNR6 ยีนนำไปสู่การลดลงอย่างรวดเร็วของ SNR6 นิพจน์ตามที่มอนิเตอร์โดยการสอบวิเคราะห์ไพรเมอร์ส่วนขยาย ( รูปที่ 3B และ C ) การเปิดใช้งานของ lacZ ยีนโดยตัวกระตุ้น pol II Lex-AD ลดลงเหลือเพียง ∼60% ของกิจกรรมดั้งเดิมโดยการแทรก DNA spacer 200 bp (รูปที่ 3D แผงตรงกลางและด้านขวา) เราทดสอบว่าลดลง SNR6 นิพจน์ที่เกิดจากการย้าย UAS NS องค์ประกอบต่อไปปลายน้ำของ SNR6 สามารถได้รับการช่วยเหลือโดยตัวกระตุ้น pol II ที่ผูกไว้กับตัวเพิ่มประสิทธิภาพระยะไกล เราสังเกตว่าเซลล์ที่มีโครงสร้างตัวรายงานตัวเว้นระยะ 100 และ 200 bp แต่ไม่ใช่เซลล์ที่มีโครงสร้างแบบไม่ใช้ตัวเว้นวรรค แสดงว่าสูงกว่า (นักข่าว) SNR6 ระดับการถอดความเมื่อแปลงร่วมกับ Gal4DBD-τ138 และตัวกระตุ้น pol II Lex-AD มากกว่าเมื่อแปลงด้วย Gal4DBD-τ138 เพียงอย่างเดียว (เปรียบเทียบ 'ไม่มีตัวเว้นวรรค' ในรูปที่ 3B เลน 1 และ 5, '100 bp spacer' เลน 2 และ 6, '200 bp spacer' เลน 3 และ 7 และรูปที่ 4B ) รูปที่ 3C แปลง SNR6 การแสดงออกเป็นหน้าที่ของระยะห่างระหว่างนักข่าว SNR6 และ UAS NS ธาตุ. การแสดงออกร่วมของ Gal4DBD-τ138 และ Lex-AD เพิ่มขึ้น SNR6 การแสดงออกเฉพาะในระยะทาง (100 และ 200 bp) ซึ่ง Lex-AD สามารถเปิดใช้งาน lacZ ยีน. ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงว่าผลของความช่วยเหลือของตัวกระตุ้น pol II Lex-AD ต่อการกระทำของ Gal4DBD-τ138 เกิดขึ้นเฉพาะในกรณีที่ระยะห่างเพิ่มขึ้นระหว่างตำแหน่งการจับของโปรตีนนี้กับ SNR6 ลำดับ. ไม่พบผลความช่วยเหลือเมื่อไซต์ที่มีผลผูกพันสำหรับ Gal4DBD-τ138 ใกล้เคียงกับยีน pol III

ดังนั้นเราจึงถามว่าผลความช่วยเหลือของตัวกระตุ้น pol II นั้นขึ้นอยู่กับการมีอยู่ของโปรโมเตอร์ pol II และ pol II Enhancer หรือไม่ ดังที่แสดงในรูปที่ 4 ผลช่วยดังกล่าวของตัวกระตุ้น pol II จำเป็นต้องมีการมีอยู่ของทั้งเอนแฮนเซอร์ pol II และลำดับโปรโมเตอร์ เนื่องจากการลบองค์ประกอบอย่างใดอย่างหนึ่งเหล่านี้ได้ยกเลิกการกระตุ้นของ SNR6 การแสดงออกของยีน ลดลง SNR6 การแสดงออกจากนักข่าว 'no-spacer', 'enhancer-deleted' และ 'promoter-deleted' เครียดต่อหน้าทั้งตัวกระตุ้น pol II และ pol III เมื่อเทียบกับการปรากฏตัวของตัวกระตุ้น pol III เพียงอย่างเดียวอาจเป็นเพราะ กับผลการยับยั้งที่ไม่เฉพาะเจาะจง (squelching) แบบเดียวกันที่เห็นในการทดลองกลุ่มควบคุม สอดคล้องกับคำอธิบายนี้ พบว่าอัตราการเติบโตลดลงเล็กน้อยเมื่อมีตัวกระตุ้น pol II ที่แสดงออกมากเกินไปสำหรับยีสต์ที่ทดสอบทั้งหมดภายใต้สภาวะที่ไม่ผ่านการคัดเลือก (ไม่แสดงข้อมูล) ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการมีอยู่พร้อมกันของเอนแฮนเซอร์และโปรโมเตอร์ pol II เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับผลของการช่วยกระตุ้นของ pol II activator Lex-AD ต่อการกระทำของ Gal4DBD-τ138 ที่ระยะห่างที่เพิ่มขึ้นระหว่างตำแหน่งการจับของโปรตีนนี้กับ SNR6 ลำดับ.

เราให้เหตุผลว่าการลดลง SNR6 การแสดงออกที่เกิดจากระยะห่างที่เพิ่มขึ้นระหว่าง UAS NS องค์ประกอบและ SNR6 โปรโมเตอร์สามารถได้รับการช่วยเหลือโดยการก่อตัวของลูปที่นำตัวกระตุ้นที่ถูกผูกไว้ Gal4DBD-τ138 ซึ่งอยู่ไกลออกไปใกล้กับ SNR6 โปรโมเตอร์ การกระตุ้นการเสริมประสิทธิภาพ Pol II ในยีสต์ถูกจำกัดไว้ที่ระยะ ∼1200 bp ( 5 – 7 ) สารเสริมยีสต์ pol II ที่ไม่สามารถกระตุ้นยีนนักข่าวได้เนื่องจากระยะห่างที่มากไปยังโปรโมเตอร์ที่เกี่ยวข้อง (>1200 bp) จึงอาจได้รับการช่วยเหลือในลักษณะที่คล้ายกับการช่วยเหลือของ SNR6 การแสดงออก. การเปิดใช้งานเอนแฮนเซอร์ที่อยู่ห่างไกลอีกครั้งจึงต้องการโปรตีนที่อำนวยความสะดวกในการสื่อสารของเอนแฮนเซอร์–โปรโมเตอร์โดยนำเอนแฮนเซอร์เข้าใกล้โปรโมเตอร์ที่ถูกควบคุมด้วยเหตุนี้จึงวนลูปออก DNA ที่แทรกแซง GAGA โปรตีนที่เข้ารหัสโดย Essential Trithorax เหมือน ( Trl ) ยีนของ แมลงหวี่ melanogaster ได้รับการแสดงว่าทำงานเกี่ยวกับโครโมโซมจำนวนมากและจำเป็นสำหรับการแสดงออกของยีนต่างๆ ที่หลากหลาย (29 - 32) ในหลอดทดลอง GAGA อำนวยความสะดวกในการถอดความของเอนแฮนเซอร์ที่อยู่ห่างไกลโดยเชื่อมโยงพวกมันเข้ากับโปรโมเตอร์ที่สืบเชื้อสายมาจากพวกมันผ่านการโอลิโกเมอไรเซชันเมื่อจับกับ DNA (24, 33, 34) ดังนั้น ปัจจัยเช่น GAGA ที่สามารถเชื่อมโยงตัวเสริมที่อยู่ห่างไกลกับโปรโมเตอร์ที่เกี่ยวข้องได้ ในหลอดทดลอง ควรเปิดใช้งานเอนแฮนเซอร์เพื่อกระตุ้นการถอดรหัสจากระยะเอนแฮนเซอร์–โปรโมเตอร์ที่ใหญ่กว่าที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติในยีสต์ NS lacZ ยีนนักข่าวขนาบข้างด้วยองค์ประกอบ GAGA หลายตัวที่มี USA . สี่ตัว NS -ผูกไซต์ระหว่างจุดสิ้นสุด 3′ ของ lacZ ยีนและองค์ประกอบ GAGA ดาวน์สตรีมถูกรวมเข้ากับจีโนม ( รูปที่ 5A ) ตามที่คาดไว้จากงานก่อนหน้านี้ ทั้ง Gal4p หรือ GAGA ตัวกระตุ้นแบบคลาสสิกที่แสดงให้เห็นว่าทำหน้าที่เป็นตัวขจัดกลิ่นแทนที่จะเป็นตัวกระตุ้นแบบคลาสสิก ไม่ได้เปิดใช้งานการถอดความของ lacZ ยีนนักข่าว ( 35 ) อย่างไรก็ตาม การแสดงออกร่วมส่งผลให้นักข่าวมีการแสดงออกที่ต่ำแต่แข็งแกร่ง สิ่งนี้ไม่เพียงแต่น่าทึ่งเพราะระยะทางที่ไม่เคยเกิดขึ้นมาก่อน แต่ยังเป็นเพราะตัวกระตุ้นแบบคลาสสิก pol II ในยีสต์ แสดงให้เห็นว่าไม่ทำงานจากตำแหน่งที่อยู่ปลายน้ำของกล่องทาทา (36, 37) ดังนั้นเราจึงสรุปได้ว่า Gal4p ได้รับคัดเลือกให้เป็นภูมิภาคต้นน้ำของกล่อง TATA ของ Gal1 โปรโมเตอร์โดยปัจจัย GAGA แบบทวีคูณที่ผูกกับไซต์ที่ปลายน้ำและต้นน้ำที่สอดคล้องกันของ lacZ ยีน.


ตัวยับยั้งการเพิ่มประสิทธิภาพ

ดังที่ได้กล่าวไว้ก่อนหน้านี้ เมื่อเทียบกับการกลายพันธุ์ทางเคมี NS- การกลายพันธุ์ขององค์ประกอบนั้นไม่มีประสิทธิภาพในการที่การกลายพันธุ์ที่ทำให้ถึงตายเกิดขึ้นได้เพียง 12% ของการแทรก ในขณะที่ EMS ทำให้เกิดการกลายพันธุ์ที่ถึงตาย 60 ถึง 80% ต่อโครโมโซม สองกลยุทธ์ได้รับการพัฒนาเพื่อขัดขวางการเพิ่มประสิทธิภาพภายในเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการกลายพันธุ์ของ NS องค์ประกอบ การกระทำครั้งแรกเพื่อบล็อกกิจกรรมของตัวเสริมโดยใช้ a NS องค์ประกอบที่มีลำดับซึ่งผูกมัดโดยโปรตีนที่เรียกว่า Suppressor of Hairy-wing (Su[Hw]) ซึ่งขัดขวางการทำงานร่วมกันของเอนแฮนเซอร์กับโปรโมเตอร์ภายในร่างกาย ( Roseman et al., 1995 รูปที่ 2B) เดิมไซต์ที่มีผลผูกพัน Su (Hw) ถูกค้นพบเนื่องจากจำเป็นสำหรับกิจกรรมการกลายพันธุ์ของ ยิปซี องค์ประกอบที่เคลื่อนย้ายได้ ( Corces and Geyer, 1991). Su(Hw) แสดงออกในเนื้อเยื่อส่วนใหญ่ตลอดการพัฒนา ( Harrison et al., 1993) และความสัมพันธ์ของโปรตีนนี้กับตำแหน่งการจับ (มีอยู่ในประเภท wild-type ยิปซี องค์ประกอบ) ป้องกันการมีปฏิสัมพันธ์ของเอนแฮนเซอร์กับโปรโมเตอร์ ดังนั้น การแทรก a ยิปซี องค์ประกอบระหว่างเอนแฮนเซอร์และโปรโมเตอร์ช่วยให้ Su(Hw) บล็อกการโต้ตอบระหว่างเอนแฮนเซอร์และโปรโมเตอร์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ ( Holdridge and Dorsett, 1991 Roseman et al., 1993) NS องค์ประกอบที่มีไซต์การผูก Su (Hw) มีประโยชน์อย่างยิ่งเพราะส่วนใหญ่ NS องค์ประกอบแทรกเข้าไปในลำดับการกำกับดูแลของยีน 5′ การแก้ไข NS องค์ประกอบที่มีไซต์การจับ Su (Hw) ทำหน้าที่เป็นสารก่อกลายพันธุ์ที่มีประสิทธิภาพมากกว่าปกติ NS องค์ประกอบ โดย 27% เทียบกับ 12% ของการแทรกที่ก่อให้เกิดการตาย ( Roseman et al., 1995)

ในกลยุทธ์ที่สอง โดยอาศัยองค์ประกอบ EP ไซต์ UAS หลายแห่งถูกรวมเข้าด้วยกันต่อหน้าโปรโมเตอร์ที่น้อยที่สุดที่ส่วนท้าย 3′ ของ NS องค์ประกอบ ( รูปที่ 2C). เมื่อใส่เข้าไปแล้ว NS องค์ประกอบอนุญาตให้มีการแสดงออกนอกมดลูกของยีนจีโนมใด ๆ ที่อยู่ที่ปลาย 3′ ของ NS- การแทรกองค์ประกอบ ( Rorth, 1996 รูปที่ 2C) ดังนั้นจึงป้องกันการเข้าถึงตัวเสริมภายนอกใด ๆ กับโปรโมเตอร์สายเลือดเดียวกัน ดังแสดงในรูปที่ 2C, the NS องค์ประกอบประกอบด้วย นอกเหนือจากไซต์ที่มีผลผูกพัน Su(Hw) แล้ว ยังมีไซต์ UAS ทั้งหมด 14 ไซต์ที่ต้นน้ำของโปรโมเตอร์แมลงหวี่ หลังจากชุดเริ่มต้นของการแทรก EP ถูกสร้างขึ้น สายพันธุ์ที่ประกอบด้วย EP สามารถข้ามไปยังสายพันธุ์ที่แสดง GAL4 ในเซลล์หรือเนื้อเยื่อที่จำเพาะได้ ดังนั้น จึงยอมให้มีการแสดงออกอย่างไม่ถูกต้องของยีนในเซลล์หรือเนื้อเยื่อที่ระบุโดยสายพันธุ์ที่แสดงออก GAL4 สายพันธุ์ GAL4 สามารถเป็นได้ทั้งความเครียดจากตัวตรวจจับเอนแฮนเซอร์หรือสายพันธุ์ที่แสดงออก GAL4 จากโปรโมเตอร์ที่โคลนนิ่ง ( Rorth, 1996 Rorth et al., 1998) ข้อดีของวิธีนี้คือเป็นแบบมีเงื่อนไข แม้จะอนุญาตให้มีหน้าจอสำหรับการกลายพันธุ์ที่มีผลร้ายแรงหรือการกลายพันธุ์ที่ปราศจากเชื้อ นอกจากนี้ยังมีประสิทธิภาพเนื่องจากสามารถใช้สายพันธุ์ EP ชุดเดียวกันเพื่อศึกษาผลกระทบของการแสดงความรู้สึกผิดในเนื้อเยื่อต่างๆ มากมาย โดยการข้ามไปยังสายพันธุ์ GAL4 ที่ต่างกัน ยิ่งไปกว่านั้น ฟีโนไทป์ที่สูญเสียการทำงานที่เกิดจากองค์ประกอบ EP หรือการตัดตอนที่ไม่แม่นยำของมันควรนำมาเปรียบเทียบกับฟีโนไทป์ที่เกิดจากการแสดงออกของยีนนอกมดลูกที่เหนี่ยวนำให้เกิดการแทรก หลุมพรางของกลยุทธ์นี้คือ แน่นอนว่า การแสดงออกที่มากเกินไปหรือผิดพลาดอาจทำให้เกิดฟีโนไทป์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงซึ่งไม่เกี่ยวข้องกับการทำงานปกติของยีน


บทสรุป

การศึกษาของเราแสดงให้เห็นอย่างชัดเจนว่าเอนแฮนเซอร์ตัวแรกแต่ส่วนปลายมีบทบาทสำคัญในการรักษาบรรทัดฐานของการแสดงออกของยีนเป้าหมาย เราเสนอแบบจำลองลูกโซ่เอนแฮนเซอร์และเปิดเผยกลไกลำดับชั้นสำหรับการควบคุมยีนที่มีเอนแฮนเซอร์ตัวแรกและเอนแฮนเซอร์ซ้ำซ้อนหลายตัว โดเมนการกำกับดูแลเริ่มต้นจากเอนแฮนเซอร์ตัวแรกนี้โดยการสร้างผู้ติดต่อหลักที่มั่นคงกับโปรโมเตอร์เป้าหมายพร้อมกับลำดับของเอนแฮนเซอร์ที่ซ้ำซ้อนซึ่งเชื่อมโยงเข้าด้วยกันผ่านการโต้ตอบระหว่างเอนแฮนเซอร์และเอนแฮนเซอร์ โดยสรุป การค้นพบของเราจากงานนี้บ่งชี้ถึงคุณลักษณะส่วนปลายและแบบสัมผัสหลายจุดของตัวเพิ่มประสิทธิภาพที่สำคัญอันดับแรก และอาจให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับกลไกการจัดระเบียบของโดเมนการกำกับดูแลที่ซับซ้อน


วัสดุเสริมอิเล็กทรอนิกส์

ไดอะแกรมของโครงสร้างทรานส์ยีน

ไฟล์เพิ่มเติม 1: . แผนผังแสดงรายละเอียดที่เกี่ยวข้องของทรานส์ยีนที่ทดสอบและตัวย่อที่สอดคล้องกัน องค์ประกอบหลัก ได้แก่ : cfos - โปรโมเตอร์ขั้นต่ำ [34] KalTA4 - ฟิวชันโปรตีน Gal4-VP16 ที่ปรับให้เหมาะสมที่สุด [43] GI - อินตรอน beta-globin ของกระต่ายเพื่อส่งเสริมความเสถียรของ mRNA [89] ป้า - SV40 หรือลำดับ polyadenylation ฮอร์โมนการเจริญเติบโตของวัว 2xNRSE - การทำซ้ำของไซต์ NRSE ฉันทามติ 21 bp [33] lox - ไซต์การรวมตัวใหม่ของ loxP เพื่ออนุญาตการแลกเปลี่ยนเทปยีน [92] UAS - ลำดับตัวกระตุ้นต้นน้ำ 17 bp [63] เฉพาะสำหรับโดเมนการจับ DNA ของ Gal4 (ด้วยจำนวนการทำซ้ำที่ระบุ เช่น 5x หรือ 14x) E1b - โปรโมเตอร์พื้นฐานจากปลาคาร์พ beta-actin [37] Crest1 - องค์ประกอบเอนแฮนเซอร์ 800-bp มีลักษณะเป็นองค์ประกอบเฉพาะเซลล์ประสาทสั่งการของกะโหลกศีรษะ [35] 2A - ลำดับเปปไทด์ไวรัส 2A ของสุกร [86] ส่งเสริมการแสดงออกที่เท่ากันของข้อความ multicistronic [87] nfsB - Escherichia coli ยีนที่เข้ารหัส prodrug แปลงเอ็นไซม์แบคทีเรีย nitroreductase (Ntr) ซึ่งส่งเสริมการระเหยของเซลล์ที่เกิดจากสารเคมี [52, 53, 88] เขา - องค์ประกอบโปรโมเตอร์ 365-bp จากเอนไซม์ฟักไข่ 1a โลคัส (he1a) ที่อนุญาตการตรวจจับสายรายงาน UAS อย่างง่ายดายในกรณีที่ไม่มีองค์ประกอบไดรเวอร์ Gal4-VP16 (ดูไฟล์เพิ่มเติม 5) นักข่าวเรืองแสงรวม: M-YFP - การติดแท็กเมมเบรน (ลำดับ Palmitoylation คู่จาก Xenopus gap43 locus [93] โปรตีนเรืองแสงสีเหลือง 'ปรับปรุง' (EYFP) M-tYFP - เมมเบรนติดแท็ก (เหมือนข้างบน) โปรตีนเรืองแสงสีเหลือง 'แท็ก' โมโนเมอร์ (tagYFP) mCherry - โปรตีนเรืองแสงสีแดงโมโนเมอร์ [94] (PNG 107 KB)

การเปรียบเทียบกับดัก Enhancer ± NRSE

ไฟล์เพิ่มเติม 2: . ภาพคอนโฟคอลของอีก 12 NRCK (กล่องซ้าย) และ 6 CK (กล่องขวา) แสดงเพื่อสนับสนุนข้อมูลฟีโนไทป์ที่สรุปไว้ในรูปที่ 1S แต่ละบรรทัดถูกกำหนดโดยหมายเลขอัลลีลแปลงพันธุ์ (เช่น gmc601) และด้วยคุณลักษณะฟีโนไทป์ (เช่น ประสาท ผสม ไม่ใช่ประสาท) ที่จัดให้มีไว้ที่ด้านล่างขวาของชุดรูปภาพแต่ละชุด ข้อมูลภาพความละเอียดสูงเพิ่มเติมสามารถดูได้ที่ [47] (PNG 2 MB)

การถ่ายภาพที่มีความละเอียดสูงของการติดฉลากเซลล์ประสาทของ branchiomotor

ไฟล์เพิ่มเติม 3: . (เอ-อี) ภาพคอนโฟคอลของสายแปลงพันธุ์ NRC1CK-5xY2N 6-dpf (Tg(2xNRSE-CREST1-cfos:KalTA4, 5xUAS-E1b:YFP-2A-nfsB)lmc003) แสดงการติดฉลากจำเพาะของปมประสาทเซลล์ประสาทสาขา เมื่อไซต์ NRSE ถูกวางไว้ที่ต้นน้ำของ CREST1-cfos การแสดงออกก็ถูกจำกัดเฉพาะประชากรย่อยของเซลล์ประสาทสั่งการในกะโหลกศีรษะที่มีรูปแบบการแสดงออกซึ่งเดิมมีลักษณะเฉพาะตามที่ระบุโดย CREST1 [35] (B, C) การแสดงออกของปมประสาทมอเตอร์รวมถึงเส้นประสาทสมอง X (วากัส, ลูกศรในบริเวณสมองหลัง), VII (หน้า, หัวลูกศรลง), ด้านหน้าและด้านหลัง V (trigeminal, หัวลูกศรขึ้น) IV และ III (trochlear และ oculomotor ตามลำดับ, ขวา หัวลูกศร). (D, E) เส้นประสาทไขสันหลังที่ไม่ปรากฏชื่อ (PNG 273 KB)

การแสดงออกของเซลล์ประสาทในช่วงต้นของทรานส์ยีนไดรเวอร์ NRSE Gal4

ไฟล์เพิ่มเติม 4: . ภาพคอนโฟคอลของ 2-dpf triple transgenic line (ฯลฯ(2xNRSE-cfos:KalTA4) gmc607 Tg(14xUAS:nfsB-mCherry)c264 Tg(elavl3:EGFP)knu3) แสดงการแสดงออกของระบบประสาทในระยะเริ่มต้นโดยทั่วไป (ลูกศรระบุเซลล์ประสาทที่มีป้ายกำกับคู่) ของเส้น NRCK (ไดรเวอร์ NRSE Gal4) (PNG 373 KB)