ข้อมูล

การแยกชิ้นส่วน DNA ที่เล็กกว่าและชิ้นส่วนที่ใหญ่กว่าโดยไม่ใช้เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส?


สำหรับการทดลองที่จะเกิดขึ้น ฉันจะมีชิ้นส่วนดีเอ็นเอสองชนิดในตัวอย่างหลังจากขั้นตอนของปฏิกิริยาเฉพาะ: อย่างแรกจะมีชิ้นส่วนที่มีความยาวประมาณ 170 bps จากนั้นจะมี Fragment ที่มีความยาวประมาณ 270 bps ขึ้นไป

ฉันต้องการดูแลแฟรกเมนต์ทั้งหมดที่มีความยาว 270 bps ขึ้นไป และทิ้งแฟรกเมนต์ทั้งหมดที่มีความยาว 170 bps ทิ้ง

แน่นอน ฉันสามารถเรียกใช้ทุกอย่างบนเจลและรวบรวมเฉพาะแบนด์เหล่านั้นที่สูงกว่า 170 bps อย่างไรก็ตาม ฉันสงสัยว่ามีสิ่งที่สวยงามกว่าที่จะบรรลุเป้าหมายนั้นหรือไม่ ตัวอย่างเช่น เราสามารถใช้ตัวกรองที่รวบรวมเฉพาะส่วนย่อยที่มีขนาด 200 หรือ 250 bps ขึ้นไป และชิ้นส่วนที่มีขนาดเล็กกว่าจะไหลผ่านตัวกรอง เป็นไปได้อย่างไรและถ้าเป็นเช่นนั้น? หรือคุณอยากจะแนะนำอะไรอีกไหม?

ขอบคุณมากสำหรับการสนับสนุนของคุณล่วงหน้า!


ทางเลือกหนึ่งคือการใช้ลูกปัด SPRI เช่นเดียวกับที่จำหน่ายโดย Ampure (ลูกปัด Ampure XP) เพื่อแยกชิ้นส่วนดีเอ็นเอตามขนาด โดยการปรับอัตราส่วนของลูกปัดต่อตัวอย่าง คุณสามารถเลือกผูกชิ้นส่วนที่มีความยาวบางจุดได้ โดยไม่รวมส่วนที่มีความยาวอื่นๆ ดังที่เห็นในภาพต่อไปนี้:

จากภาพนี้ คุณอาจลองใช้อัตราส่วนลูกปัดต่อตัวอย่างที่ 0.7 เพื่อแยกส่วนย่อยที่ต่ำกว่า 200bp หรืออัตราส่วนระหว่าง 0.7 ถึง 0.6 เพื่อแยกเฉพาะส่วนย่อยที่อยู่ต่ำกว่าบางส่วนระหว่าง 200 ถึง 250bp ข้อดีของลูกปัดบนเจลคือเวลาที่ต้องใช้ การเลือกขนาดด้วยลูกปัดใช้เวลาประมาณ 10 นาที เทียบกับเจลอาจใช้เวลา 30 นาทีขึ้นไป (รวมถึงการสกัดด้วย)

เช่นเดียวกับขั้นตอนทางอณูชีววิทยา การทดสอบและตรวจสอบให้แน่ใจว่าได้ผลสำหรับคุณ ตัวอย่างเช่น อาจเป็นความคิดที่ดีที่จะนำส่วนย่อยของตัวอย่างและเปรียบเทียบความยาวและผลตอบแทนที่คุณได้รับจากช่วงความเข้มข้นของเม็ดบีดและ/หรือเปรียบเทียบผลผลิตที่คุณได้รับจากการใช้เจลกับ (ในกรณีนี้) เม็ดบีด .


ในใจของฉัน การแยกเจล (โดยใช้เจลเปอร์เซ็นต์ที่ค่อนข้างสูงเพื่อแยกแถบออกให้มากที่สุด) และการตัดออกด้วยตนเองเป็นทางเลือกที่ดีที่สุด ปัญหาเกี่ยวกับตัวกรองตัดน้ำหนักโมเลกุลคือค่าที่ให้ (เช่น 5000 Da) เป็น เฉลี่ย ขนาดรูพรุนก็ไม่แน่ชัด ดังนั้น ความพยายามที่จะแยก 270 bp ออกจาก 170 bp oligos จะจบลงด้วยโครงสร้างที่สั้นกว่าบางส่วนที่สิ้นสุดในผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้าย และลำดับที่ยาวกว่าบางส่วนในการไหลผ่าน โอกาสในการค้นหาผลิตภัณฑ์นอกชั้นวางที่ตรงตามข้อกำหนดด้านขนาดของคุณก็ต่ำเช่นกัน ใช้ชุดคิทประเภทนี้เฉพาะในกรณีที่คุณแยกผลิตภัณฑ์ PCR ขนาด 300 bp ออกจากไพรเมอร์ที่ไม่ได้ใช้ เป็นต้น

คุณสามารถทำคอลัมน์โครมาโตกราฟีโดยใช้เมทริกซ์การยกเว้นขนาด แต่นั่นก็เหมือนกับการใช้เจล ข้อได้เปรียบเพียงอย่างเดียวคือสามารถปรับขนาดได้ ดังนั้นหากคุณมีผลิตภัณฑ์ PCR จำนวนมากที่ต้องแยกออก (สมมติว่า 5 หรือ 10 มล.) จะเรียกใช้คอลัมน์เดียวได้ง่ายกว่าการโหลดเลนจำนวนมากในเจล


ดูวิดีโอ: การพฒนาเทคนคมลตเพลกซพซอารเพอตรวจวเคราะห. สวก. (มกราคม 2022).