ข้อมูล

พลาสมิดชนิดใดแสดง T7 RNA polymerase ในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมได้


ไม่มีใครรู้ว่าพลาสมิดชนิดใดสามารถแสดง T7 RNA polymerase ในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมได้ ฉันอยากจะถ่ายมันด้วยพลาสมิดตัวอื่นที่มียีนที่น่าสนใจภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ T7 ขอบคุณมาก!


ลำดับผู้นำที่สามารถเพิ่มการแสดงออกของอาร์เอ็นเอและการสังเคราะห์โปรตีนในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม

Brian P. Wellensiek, Andrew C. Larsen และ Julia Flores มีส่วนสนับสนุนงานนี้อย่างเท่าเทียมกัน

ศูนย์เวชศาสตร์วิวัฒนาการและสารสนเทศ, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

ศูนย์เวชศาสตร์วิวัฒนาการและสารสนเทศ, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

ภาควิชาเคมีและชีวเคมี, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

ศูนย์โรคติดเชื้อและวัคซีน, The Biodesign Institute, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5401

School of Life Sciences, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5912

ศูนย์เวชศาสตร์วิวัฒนาการและสารสนเทศ, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

ภาควิชาเคมีและชีวเคมี, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

ติดต่อกับ: John C. Chaput, 727 E. Tyler, Tempe, AZ 85287-5301 อีเมล: [email protected] ค้นหาบทความเพิ่มเติมโดยผู้เขียนคนนี้

ศูนย์เวชศาสตร์วิวัฒนาการและสารสนเทศ, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

Brian P. Wellensiek, Andrew C. Larsen และ Julia Flores มีส่วนสนับสนุนงานนี้อย่างเท่าเทียมกัน

ศูนย์เวชศาสตร์วิวัฒนาการและสารสนเทศ, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

ศูนย์เวชศาสตร์วิวัฒนาการและสารสนเทศ, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

ภาควิชาเคมีและชีวเคมี, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

ศูนย์โรคติดเชื้อและวัคซีน, The Biodesign Institute, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5401

School of Life Sciences, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5912

ศูนย์เวชศาสตร์วิวัฒนาการและสารสนเทศ, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

ภาควิชาเคมีและชีวเคมี, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

ติดต่อกับ: John C. Chaput, 727 E. Tyler, Tempe, AZ 85287-5301 อีเมล: [email protected] ค้นหาเอกสารเพิ่มเติมโดยผู้เขียนคนนี้


T7 และ DH5 alpha - ช่วยฉันล้างข้อมูลบางอย่าง (ก.พ./04/2553 )

สวัสดี !
ฉันกำลังทำวิทยานิพนธ์ระดับปริญญาโทและพยายามจะเคลียร์บางอย่างออกเพื่อที่ฉันจะได้เข้าใจอย่างถ่องแท้ ตอนนี้ฉันกำลังตรวจสอบระบบนิพจน์ T7 ถ้าฉันเข้าใจถูกต้อง T7 RNA polymerase มักจะรวมอยู่ในจีโนมโครโมโซมภายใต้การควบคุมของผู้ดำเนินการ lac ที่เริ่มต้นการถอดรหัสด้วยการเพิ่ม IPTG จากนั้นพอลิเมอเรสพบโปรโมเตอร์ T7 บนพลาสมิดและเริ่มถอดความ mRNA จากไซต์นี้

อย่างไรก็ตาม ฉันเคยอ่านเจอที่ไหนสักแห่งที่แบคทีเรีย DH5 alpha ของฉันไม่มียีน T7 RNA polymerase ของมันเอง และสิ่งนี้ควรปรากฏบนพลาสมิดและจำเป็นต้องเปลี่ยนรูป นี่เป็นเรื่องจริงหรือไม่? ฉันสงสัยว่ามันไม่ใช่ เพราะฉันไม่เห็นว่าพลาสมิดของฉัน (pTZ19R และ pSE420) มีสิ่งนั้นอยู่ คุณช่วยฉันเคลียร์ของได้ไหม

สิ่งที่คุณอ่านถูกต้อง การแสดงออกของ T7 ส่วนใหญ่เกิดขึ้นในสายพันธุ์ของแบคทีเรียที่ได้รับการไลโซเจไนซ์ด้วย DE3 phage โดยมี T7 RNA polymerase ภายใต้การควบคุมของ lac โปรโมเตอร์ DH5a ไม่มีสิ่งนี้ โดยปกติ สายพันธุ์ที่มีการดัดแปลงนี้จะระบุไว้ในชื่อของมัน เช่น BL21 (DE3) เหตุผลที่โดยทั่วไป DH5a ไม่มีการดัดแปลงนี้เป็นเพราะการแสดงออกของโปรตีนไม่ดี เนื่องจากมันยังมี lon protease ซึ่งมีแนวโน้มที่จะย่อยสลายโปรตีนที่แสดงออก สายพันธุ์ BL21 ถูกตัดออกสำหรับสิ่งนี้และโปรตีเอสอื่น ๆ

คุณสามารถนำ lac โปรโมเตอร์และยีน T7 RNA polymerase ติดตัวไปบนพลาสมิด (ตัวเดียวกันหรือตัวเปลี่ยนรูปร่วม) ใน DH5a ได้ ไม่กี่คนที่ทำเช่นนี้เพราะพวกเขาสนใจเกี่ยวกับการแสดงออกของโปรตีนที่เกิดขึ้น

ขอบคุณสำหรับคำตอบของคุณ! ฉันหวังว่าฉันจะเข้าใจอะไรผิดไป ดังนั้นมันน่าจะสมเหตุสมผลกว่า.. ฉันกลับไปที่แหล่งที่มาดั้งเดิมของฉัน และพวกมันก็โคลนยีนของฉันเป็นเวคเตอร์การแสดงออก pTZ19R และแปลงเป็น DH5a สำหรับการแสดงออก ถ้า DH5a เป็นสายพันธุ์การแสดงออกของยีนที่ไม่ดี ทำไมใครๆ ก็ต้องการทำเช่นนั้น? และการแสดงออกจะเกิดขึ้นได้อย่างไรหากไม่มี T7 RNA polymerase?

ฉันได้ลองค้นคว้าเกี่ยวกับเรื่องนี้แล้ว แต่ทุกอย่างกลับทำให้ฉันสับสนมากขึ้น ฉันพบสิ่งนี้ในเอกสารข้อมูล Invitrogen:
สำคัญ: DH5α E. coli ไม่ต้องการ IPTG เพื่อกระตุ้นการแสดงออกจากโปรโมเตอร์ lac แม้
แม้ว่าความเครียดจะเป็นการแสดงออกถึง Lac repressor จำนวนสำเนาของพลาสมิดส่วนใหญ่เกิน
หมายเลขตัวกดในเซลล์ หากคุณมีความกังวลเกี่ยวกับการได้รับระดับสูงสุดของ
นิพจน์ เพิ่ม IPTG ไปที่ความเข้มข้นสุดท้าย 1 mM

แหล่งที่มาดั้งเดิมของฉันไม่ได้กล่าวถึง IPTG เลย และฉันคิดว่ามันเป็นเพราะพวกเขาไม่ต้องการให้ข้อมูลทั้งหมดเกี่ยวกับการผลิตโปรตีน แต่บางทีพวกเขาอาจไม่ได้ใช้มันเลย

นอกจากนี้ ฉันยังสังเกตเห็นว่าฉันได้ผลลัพธ์ที่ชัดเจนยิ่งขึ้นใน SDS-PAGE ของฉันในขณะที่ใช้วิธีที่เกี่ยวข้องกับ PMSF ความคิดเห็นของผู้บังคับบัญชาของฉันคือไม่จำเป็น แต่ฉันเดาว่ามันจะปิดกั้นโปรตีเอส lon และมีผลบางอย่างหรือไม่? ฉันอาจจะทำการทดสอบมากกว่านี้ เพื่อความบันเทิงส่วนตัว..

โอเค ฉันแค่พูดพล่ามกับคำถามของตัวเอง แต่คำถามแรกสำคัญที่สุด พอลิเมอเรสอยู่ที่ไหน?

พลาสมิด pTZ19R มีทั้งโปรโมเตอร์ lac และโปรโมเตอร์ T7 ที่ต้นน้ำของไซต์โคลนหลายแห่ง ในสายพันธุ์ LacI สิ่งนี้จะแสดงจากโปรโมเตอร์ lac โดยไม่เกี่ยวข้องกับโปรโมเตอร์ T7 โปรโมเตอร์ T7 อยู่ที่นั่นเพื่อให้แสดงออกในสายพันธุ์ BL21 (DE3) ถ้าฉันสนใจโปรตีน ฉันจะแยกย่อยเป็น BL21(DE3) และกระตุ้นด้วย IPTG จากนั้น (ในขณะที่คุณทำอยู่) ทำให้บริสุทธิ์เมื่อมี PMSF แม้ว่าจะมีความสำคัญน้อยกว่าในสายพันธุ์ BL21


ผลลัพธ์

เวกเตอร์ RNA ที่ไม่เกี่ยวกับเซลล์

Noncytopathic replicon SINrep19 ได้รับการออกแบบเป็น double subgenomic RNA vector โดยใช้ 5′-promoter สำหรับการแสดงออกของยีนต่างประเทศ และ 3′-promoter เพื่อขับเคลื่อนการแสดงออกของ แพ็ก (รูปที่ 1NS). เซลล์ BHK ถูกทรานส์เฟกด้วย RNA จำลองแบบ capped ที่สังเคราะห์ขึ้น ในหลอดทดลองชุบแล้วพักไว้ 12-18 ชม. จากนั้นเราได้กำหนดการคัดเลือกสำหรับเซลล์ที่ได้รับการทรานส์เฟกอย่างมีประสิทธิผลด้วยเรพลิคอนโดยการเพิ่มพูโรมัยซินลงในอาหารเลี้ยงเซลล์ ภายใน 24 ชั่วโมง เซลล์ควบคุมหรือเซลล์ที่ไม่ผ่านการทรานส์เฟกถูกกำจัดอย่างสมบูรณ์ (I.F., E.A. , T. A. Hoffman, B.M.P. , M. S. Lippa, S.S. และ C.M.R. ข้อมูลที่ไม่ได้เผยแพร่)

เวกเตอร์ SIN ที่ไม่เกี่ยวกับเซลล์ (NS) SINrep19 RNA ซึ่งเป็นเวกเตอร์ RNA noncytopathic ของ subgenomic คู่ ถ่ายทอดยีนต่างประเทศและ แพ็ก ยีนจากแม่แบบเส้นลบโดยใช้โปรโมเตอร์ย่อยที่แยกจากกัน (ตำแหน่งโปรโมเตอร์ถูกระบุด้วยลูกศรในโครงสร้างทั้ง DNA และ RNA) (NS) bipartite noncytopathic RNA vector อาศัย SINrep18 เพื่อสนับสนุนการจำลองแบบของจีโนม SIN ที่บกพร่องและรบกวนซึ่งมียีนที่น่าสนใจ ปลายทาง 5′ ของ DI RNA มีลำดับ tRNA Asp (20) () SINrep21 เป็นเวกเตอร์ดีเอ็นเอสำหรับตัวจำลอง SINrep19 หลังจากการถ่าย DNA เรพลิคอนอาร์เอ็นเอจะถูกคัดลอกผ่านเอ็นไซม์นิวเคลียร์และถูกส่งไปยังไซโตพลาสซึม ตัวจำลองเริ่มต้นการจำลองแบบอัตโนมัติและแสดง แพ็ก ยีนและยีนต่างประเทศที่น่าสนใจ การไหลออกหมายถึงไซต์ที่สะดวกสำหรับการถอดความ MCS ไซต์การโคลนหลายตัว

การเปรียบเทียบกิจกรรม β-gal ทั้งหมดที่ส่งโดย SINrep19/แลคZ กับสิ่งนั้นจาก SIN อื่น /แลคZ replicons แสดงไว้ในตารางที่ 1 ตัวจำลองถาวรผลิตเพียง ≈4% ของกิจกรรมของเอนไซม์ที่ผลิตโดย cytopathic SINrep3/แลคตัวจำลอง Z สิ่งนี้สอดคล้องกับระดับที่ลดลงของ SIN RNA ของจีโนมและซับจีโนมที่สังเกตพบในเซลล์ที่ถ่ายด้วยการจำลองแบบ noncytopathic ของผู้ปกครอง (I.F. , E.A. , T. A. Hoffman, B.M.P. , M. S. Lippa, S.S. และ C.M.R. , ข้อมูลที่ไม่ได้เผยแพร่)

การแสดงออกของ β-gal โดยตัวจำลอง SIN ที่แตกต่างกัน

กลยุทธ์การใช้ DI RNA

คุณลักษณะที่กำหนดของอนุภาค alphavirus DI คือการเพิ่มระดับการจำลองแบบ RNA เหนือไวรัส wild-type หรือ helper (19) จีโนม DI ที่สนับสนุนโดยตัวจำลอง SIN ที่ไม่เกี่ยวกับเซลล์ยังสามารถแสดงระดับการจำลองแบบที่เพิ่มขึ้น และทำให้การผลิตยีนต่างประเทศเพิ่มขึ้น สำหรับ SIN DI หนึ่ง ดีเทอร์มิแนนต์ที่สำคัญถูกพบว่าเป็นการแทนที่ของโครงสร้างที่เหมือน tRNA สำหรับปลาย 5′ แท้จริงของจีโนมที่มีข้อบกพร่อง (20) DI RNAs ที่เข้ารหัสยีนต่างชนิดกันถูกสร้างขึ้นตามโครงสร้างนี้และใช้ร่วมกับการจำลองแบบ noncytopathic ที่มีโปรโมเตอร์ย่อยย่อยเพียงตัวเดียวเพื่อขับเคลื่อน แพ็ก การแสดงออกของยีน (SINrep18)

ในกลยุทธ์หนึ่ง DI RNA ถูกทรานส์เฟกเป็นเซลล์ pur R ซึ่งจำลอง SINrep18 แล้ว (รูปที่ 1NS). เพื่อแยกความแตกต่างทางฟีโนไทป์ของเซลล์ที่ทรานส์เฟก DI จากเซลล์ที่ไม่ถูกทรานส์เฟก เครื่องหมายที่เลือกได้ที่โดดเด่นที่สองถูกใช้ NS นีโอ ยีนซึ่งให้การดื้อยา G418 ถูกวางไว้ใกล้กับยีนที่สนใจและขับเคลื่อนโดยองค์ประกอบภายในของไรโบโซมเข้าของไวรัสไข้สมองอักเสบ ดิ/lacZ-นีโอ เวกเตอร์สร้าง >20 เท่าของระดับ β-gal ที่ผลิตโดย SINrep19 แต่น้อยกว่าของการจำลอง cytopathic เล็กน้อย (ตารางที่ 1) การติดฉลากเมตาบอลิซึมของสปีชีส์ RNA ที่ดื้อต่อแอกติโนมัยซิน ในร่างกาย บ่งชี้ว่า DI RNAs ถูกจำลองแบบไปยังระดับที่สูงกว่าตัวจำลองที่ไม่เกี่ยวกับเซลล์มะเร็งเพียงอย่างเดียวและ DI/lacZ-นีโอ- นิพจน์ที่อาศัยสื่อกลางมีเสถียรภาพหลังจากผ่านหลายข้อความแม้ในกรณีที่ไม่มีการเลือก G418 (ไม่แสดงข้อมูล) ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าระบบเวกเตอร์ DI/replicon สามารถแสดงออกในระดับสูงของยีนแปลกปลอม เป็นไปได้มากว่าเกิดจากการทำซ้ำของจีโนม DI ที่เพิ่มขึ้นมากกว่าของเรพลิคอน

เพื่อแสดงลักษณะเพิ่มเติมของความสามารถของการจำลองแบบ noncytopathic เพื่อเสริมเวกเตอร์ DI เราได้ตรวจสอบความสามารถของ SINrep18 เพื่อกระตุ้นการแสดงออกของ luciferase ในเซลล์ที่ถ่ายทอด DI/โชคดี จากโปรโมเตอร์นิวเคลียร์ การถอดเสียงนี้ทำหน้าที่เป็นเทมเพลตสำหรับการจำลองแบบและการถอดความเมื่อมีการแนะนำไวรัสตัวช่วยหรือตัวจำลอง (11) ดังตารางที่ 2 แสดงให้เห็น เซลล์ที่ไม่ถูกกระตุ้นจะสะสมระดับของกิจกรรม luciferase ในระดับต่ำ ซึ่งได้รับการปรับปรุงโดยการติดเชื้อและสัดส่วนกับปริมาณของไวรัส SIN ที่เพิ่มเข้ามา เมื่อเซลล์เหล่านี้ถูกทรานส์เฟกด้วย SINrep18 ตามด้วยการคัดเลือกและการส่งผ่านพูโรมัยซิน กิจกรรมของลูซิเฟอเรสจำนวนมากสะสมใน 5 วันแรกและคงไว้เป็นเวลาอย่างน้อยอีก 4 วัน ดังนั้น แม้ว่าตัวจำลองที่ไม่เกี่ยวกับเซลล์มะเร็งจะแสดงโปรตีนต่อหน่วยของเวลาน้อยกว่าคู่ผสมทางพยาธิวิทยาของพวกมัน แต่ความสามารถในการแสดงออกที่ยืดเยื้อสามารถนำไปสู่การสะสมของโปรตีนในระดับที่สูงมาก

การชักนำของลูซิเฟอเรสโดยการจำลองแบบ noncytopathic หรือไวรัส SIN

ความถี่ในการแสดงออกของเซลล์และความเสถียรของจำนวนเซลล์เมื่อผ่านไป

ความเสถียรของเวกเตอร์นิพจน์ระยะยาวเป็นตัวกำหนดอรรถประโยชน์ของมันอย่างมาก เนื่องจากไวรัสอาร์เอ็นเอ รวมทั้ง SIN นั้นค่อนข้างเป็นพลาสติกทางพันธุกรรม เราจึงตรวจสอบรูปแบบของการแสดงออกของ β-gal ผ่านตัวทำซ้ำที่ไม่เกี่ยวกับเซลล์ ตามเวลาต่อเซลล์ ดังรูปที่ 2 แสดงให้เห็น ประชากรของเซลล์ที่จำลอง SINrep19/แลคZ มีเซลล์ลบ >10% β-gal-negative ภายในสองสามข้อความแรก และยังคงสะสมเซลล์นิพจน์เชิงลบต่อไปเมื่อมีการผ่านต่อไป พบการสูญเสียการแสดงออกที่คล้ายกันสำหรับ SINrep18 + DI/แลคZ (รูปที่ 2) และสำหรับยีนมาร์กเกอร์อื่นๆ (ไม่แสดงข้อมูล) ดังนั้น แม้จะเลือกใช้ puromycin อย่างต่อเนื่อง เช่นเดียวกับความจริงที่ว่า แลคZ และ แพ็ก ยีนมีการเชื่อมโยงทางพันธุกรรม ตัวแปรการแสดงออก-เชิงลบเกิดขึ้นภายในประชากรที่เลือก เราพิจารณาแหล่งที่มาหลักสองประการสำหรับความหลากหลายนี้: (ผม) การจำลองมีแนวโน้มที่จะสะสมการกลายพันธุ์หรือการลบใน แลคยีน Z ระหว่างการจำลองแบบ SIN และ (ii) การจำลองแบบเริ่มต้นเป็นประชากรซึ่งควรสะท้อนถึงความแตกต่างของ ในหลอดทดลอง RNA สังเคราะห์

ความคงตัวของการแสดงออก β-gal โดยการจำลองแบบ noncytopathic ในระหว่างการเคลื่อนผ่านเซลล์ (1:10 ประมาณทุก ๆ 48 ชั่วโมง) เซลล์ส่วนหนึ่งจะถูกเพาะในหลุมที่แยกจากกันและย้อมด้วย X-gal ตามที่อธิบายไว้ใน วัสดุและวิธีการ. ความคงตัวของสายพันธุ์ของเซลล์ที่ถูกโคลนซึ่งแสดงออก β-gal ได้รับการประเมินโดยใช้สำเนาพันธุ์ที่เลือกสำหรับการแสดงออกในระดับสูง เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ β-gal-negative คำนวณโดยการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ของช่องสุ่มหลายช่อง

เพื่อแก้ไขข้อกังวลข้อแรกเหล่านี้ เราตรวจสอบความเสถียรของการแสดงออกในประชากรโคลนของเซลล์ β-gal-positive ดังที่แสดงในรูปที่ 2 อนุพันธ์โคลนของ SINrep19/แลคZ รักษาการแสดงออกของ >90% β-gal ผ่าน 10 ข้อความ ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันถูกพบด้วยการโคลนเซลล์หลายเซลล์ (ไม่แสดงข้อมูล) ความเสถียรของ SINrep18 + DI/แลคZ ยังได้รับการปรับปรุงเมื่อทำการโคลนเซลล์ β-gal-positive แม้ว่าเปอร์เซ็นต์ของการแสดงออกจะลดลงในตอนที่ 10 สำหรับประชากรโคลนของทั้ง SINrep19/แลคZ และ SINrep18 + DI/แลคZ การละเว้นการเลือกไม่มีผลต่อเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ที่แสดง β-gal ในเจ็ดตอน (ไม่แสดงข้อมูล) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการสูญเสียการแสดงออกเกิดขึ้นจากการจำลองแบบ SIN แต่สิ่งนี้ไม่ได้อธิบายทั้งหมดสำหรับความไม่เสถียรในประชากรที่ไม่ได้โคลน ในทางปฏิบัติ ความไม่เสถียรนี้สามารถจัดการได้โดยใช้เซลล์ทางผ่านช่วงแรกและโดยการโคลนเซลล์ที่มีการแสดงออกในเชิงบวกโดยตรง

อัตราการกลายพันธุ์ที่สูงของ SP6 RNA polymerase อาจมีส่วนทำให้เกิดความแตกต่างเริ่มต้นภายในประชากรของเรพลิคอน ในร่างกาย การถอดความของเรพลิคอน RNA ที่ใช้งานได้โดยใช้นิวเคลียส RNA polymerase II ของเซลล์เจ้าบ้านอาจเป็นทางเลือกแทน ในหลอดทดลอง การถอดความ คล้ายกับกลยุทธ์ที่เผยแพร่ (21, 22) วิธีนี้ได้รับการทดสอบครั้งแรกโดยการสร้าง p987/SINrep19/lacZ ซึ่งมี SINrep19/แลคZ cDNA ขนาบข้างด้วย Rous sarcoma virus 5′-long terminal repeat promoter และสัญญาณ polyadenylation 40 ของไวรัส simian การจำลองแบบของเรพลิคอนนี้เริ่มต้นโดยการถ่ายทรานส์เฟกชันชั่วคราวของพลาสมิดดีเอ็นเอและการเลือกพูโรมัยซินของประชากรที่ทรานส์เฟก ประชากรดังกล่าวแสดงการแสดงออกเป็นเวลานานของ β-gal ใน >90% ของเซลล์ แม้ว่าจะสังเกตเห็นการสูญเสียการแสดงออกเพียงเล็กน้อยแต่สามารถตรวจพบได้ (รูปที่ 2) ไม่พบความแตกต่างในระดับการแสดงออกระหว่างผลิตภัณฑ์ที่แสดงออก SINrep19 กับ p987/SINrep19 จากการออกแบบนี้ เวกเตอร์ดีเอ็นเอทั่วไป pSINrep21 ถูกสร้างขึ้นในเวกเตอร์สำเนาขนาดกลาง (รูปที่ 1).

การแสดงออกของโปรตีนต่างชนิดกัน

ยีนที่เป็นตัวแทนบางตัวที่แสดงออกโดยใช้การจำลองแบบ noncytopathic แสดงในรูปที่ 3 SINrep19/GFP ประกอบด้วยเวอร์ชันสังเคราะห์ที่ปรับให้เหมาะสมที่สุดสำหรับโคดอนของมนุษย์ของ Aequeorea วิกตอเรีย ยีน GFP (12) ซึ่งนำไปสู่การเรืองแสงที่สดใสของประชากร pur R (รูปที่ 3NS). มะเดื่อ 3NS สาธิตรูปแบบการย้อมสี X-gal สำหรับตอนที่ห้า SINrep19/แลคประชากรเซลล์ที่แสดงออก Z

การแสดงออกของแบบจำลองโปรตีนผ่านทางเวกเตอร์ที่ไม่ใช่ไซโทพาทิก เซลล์ถูกเลือกหลังจากการทรานส์เฟกชันด้วย SINrep19/GFP (NS), SINrep19/แลคซี (NS), SINrep19/CD46 ( และ อี) หรือ SINrep18 (NS และ NS). เซลล์ทั้งหมดเป็นประชากรที่เป็นตัวแทนที่เลือกไว้สำหรับ pur R ตามที่อธิบายไว้ในข้อความ เซลล์ถูกเตรียมโดยการย้อมสี X-gal (NS) หรือการย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์สำหรับ CD46 ( และ NS). (อี และ NS) แสดงสภาพของเซลล์ 54 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ MV [หลายหลากของการติดเชื้อ (moi) 0.1]

เรามีความสนใจเป็นพิเศษในการใช้การจำลองแบบ noncytopathic เพื่อส่งโปรตีนไปยังทางเดินของสารคัดหลั่ง เนื่องจากผลที่ตามมาของการติดเชื้อ SIN อาจเป็นความผิดปกติของส่วนของเซลล์เหล่านี้ (23) เราแสดง CD46 ของไกลโคโปรตีนที่ผิวเซลล์ของมนุษย์ ซึ่งเกี่ยวข้องกับการควบคุมส่วนเติมเต็มและเป็นตัวรับสำหรับไวรัสหัด (MV) CD46 ถูกแสดงออกบนพื้นผิวของเซลล์ที่จำลองแบบ SINrep19/CD46 (รูปที่ 3 และ NS). เนื่องจากตัวรับนี้จำเป็นสำหรับการจับและการเข้า MV เราจึงทดสอบว่าการแสดงออกของ CD46 สามารถให้สิทธิ์ MV กับเซลล์ BHK ได้หรือไม่ ดังแสดงในรูปที่ 3 อี และ NSประชากรของเซลล์ SINrep19/CD46 แสดงให้เห็นการก่อตัวเป็นซิงค์โดยปกติที่เกิดจากการติดเชื้อ MV ในขณะที่เซลล์ SINrep18 ยังคงไม่ได้รับอนุญาต

นอกจากนี้ รูปแบบของอัลคาไลน์ฟอสฟาเตสจากรกของมนุษย์ (SEAP) ที่ยึดแบบไม่มีเมมเบรนถูกคัดหลั่งเข้าไปในตัวกลางของเซลล์ที่จำลองแบบ SINrep19/SEAP ในอัตรา 400 ng/10 6 เซลล์/24 ชั่วโมง ในทำนองเดียวกัน รูปแบบที่ตัดทอนของ E2 glycoprotein ของไวรัสตับอักเสบซี (HCV) ซึ่งไม่มีสมอเมมเบรน ถูก glycosylated อย่างเหมาะสมและกำหนดเป้าหมายสำหรับการหลั่ง (ไม่แสดงข้อมูล) โปรตีนโครงสร้างไวรัสไข้เหลือง (YF) prM/E ยังแสดงผ่าน SINrep19 และประมวลผลเป็น prM และ E อย่างเหมาะสม (ไม่แสดงข้อมูล) ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าเวกเตอร์ SIN ที่ไม่เกี่ยวกับเซลล์สามารถนำส่งโปรตีนที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพไปยังวิถีการคัดหลั่ง

การแสดงออกของ T7 RNA Polymerase

เราตรวจสอบความสามารถของ replicaons ที่ไม่เกี่ยวกับเซลล์ในการแสดงออกของ phage T7 RNA polymerase ไปยังเซลล์เจ้าบ้านโดยตรง โดยทั่วไปแล้วเอนไซม์นี้จะถูกส่งไปยังเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมโดยใช้ไวรัส recombinant vaccinia vTF7–3 และพบว่ามีประโยชน์ในวงกว้างในการแสดงออกมากเกินไปชั่วขณะของยีนแปลกปลอมที่ลอกแบบมาจากโปรโมเตอร์ T7 และสัญญาณการแปลที่เหมาะสม (24) การทำงานของ T7 RNA polymerase ที่แสดงผ่าน SINrep19/T7pol นั้นแสดงให้เห็นโดยใช้นักข่าวหลายคน ในการทดลองชุดหนึ่ง เราถ่ายเซลล์เหล่านี้ด้วยพลาสมิด DNA ที่มีโคลนไวรัส Mengo ที่ใช้งานได้ภายใต้การควบคุมการถอดรหัสของโปรโมเตอร์ T7 ดังแสดงในรูปที่ 4NSการก่อตัวของแผ่นโลหะจากไวรัส Mengo มีความเฉพาะเจาะจงกับเซลล์ที่มี SINrep19/T7pol โล่เหล่านี้มีขนาดและรูปร่างเหมือนกันกับไวรัส Mengo ที่ริเริ่มจาก ในหลอดทดลอง การถอดเสียง (ไม่แสดงข้อมูล)

การแสดงออกทางหน้าที่ของ T7 RNA polymerase (NS) โล่ไวรัส Mengo หลังจากการถ่ายเซลล์ BHK ควบคุม (SINrep18) หรือเซลล์ BHK ที่แสดงออก T7 (SINrep19/T7pol) ด้วย T7 ที่ขับเคลื่อนด้วยโคลนของไวรัส Mengo (NS) การแสดงออกของโพลีโปรตีน HCV ที่มี (ช่อง 2 และ 3) หรือไม่มีการถ่าย (ช่อง 1 และ 4) ของ pBRTM/HCV827–3011 เลน 1 และ 2 มาจากเซลล์ที่ติดเชื้อ vTF7–3 ในขณะที่เลน 3 และ 4 แสดงถึงเซลล์ที่มี SINrep19/T7pol () การแสดงออกของลูซิเฟอเรสหลังการถ่าย pEMCLucβgANS ลงในเซลล์ที่แสดง T7 RNA polymerase ผ่าน vTF7–3, SINrep19/T7pol หรือไม่แสดง T7 RNA polymerase (ตัวควบคุม) ไลเซตถูกเตรียมที่ 6, 24 หรือ 36 ชั่วโมงหลังจากการทรานส์เฟกชัน การทดลองนี้เป็นตัวแทนของการทดลองอิสระสามการทดลอง

ในการทดลองอีกชุดหนึ่ง เซลล์ที่แสดงออก T7 RNA โพลีเมอเรสถูกถ่ายทรานส์เฟกด้วย pBRTM/HCV827–3011 ซึ่งเป็นพลาสมิดที่มีบริเวณที่ไม่มีโครงสร้างของ HCV ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ T7 (25) ผลิตภัณฑ์ที่คาดหวังได้รับการกระตุ้นภูมิคุ้มกัน ซึ่งบ่งชี้ว่าโพลีโปรตีน HCV ถูกแสดงออกและผ่านกระบวนการอย่างเหมาะสม (รูปที่ 4NS, เลน 3 และ 4). สำหรับการเปรียบเทียบ เรายังแสดง phage polymerase ผ่าน vTF7–3 ซึ่งให้ผลลัพธ์ที่เหมือนกันแต่ในปริมาณที่มากกว่า (รูปที่ 4NS, เลน 1 และ 2).

เพื่อหาปริมาณของผลิตภัณฑ์ที่แสดงออก T7 ได้ดีขึ้น เราได้ตรวจสอบการแสดงออกของลูซิเฟอเรสเมื่อเวลาผ่านไปในเซลล์ที่ถ่ายด้วยพลาสมิดซึ่งเข้ารหัสยีน luc ที่ขับเคลื่อนโดยโปรโมเตอร์ T7 คือ pEMCLucβgANS (ของขวัญจาก Jon A. Wolff มหาวิทยาลัยวิสคอนซิน) เซลล์ที่แสดง T7 RNA polymerase ผ่าน vTF7–3 หรือ SINrep19/T7pol มีกิจกรรมของ luciferase มากมายตลอดเวลาที่ตรวจสอบ เซลล์ที่ติดเชื้อวัคซีนแสดงให้เห็นกิจกรรมสูงสุดก่อนหน้านี้ ซึ่งลดลง 36 ชั่วโมง ซึ่งสอดคล้องกับการทำลายเซลล์ที่ติดเชื้อด้วยวัคซีน ในทางตรงกันข้าม SINrep19/T7pol ยังคงสะสมลูซิเฟอเรสอย่างต่อเนื่อง โดยแซงหน้ากิจกรรมในเซลล์ที่ติดเชื้อ vTF7–3 ระหว่าง 24 ถึง 36 ชั่วโมง ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า SINrep19/T7pol สามารถแสดงการทำงานของ T7 RNA polymerase ในระดับที่เทียบได้กับ vTF7–3 แต่มีความเป็นพิษต่อเซลล์น้อยกว่า


บทสรุป

ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าชุดของปัจจัยการถอดรหัสสังเคราะห์แบบตั้งฉากตั้งฉาก (ที่มีกิจกรรมตามเป้าหมายที่แข็งแกร่งและกิจกรรมนอกเป้าหมายต่ำ) สามารถสร้างได้ อี. โคไลและนี่เป็นระบบกระตุ้นการทำงานแบบตั้งโปรแกรมได้ระบบแรกในแบคทีเรียที่เราทราบ โดยขยายช่วงของตัวเลือกที่มีให้สำหรับกิจกรรมการถอดรหัสในแบคทีเรีย และเสนอโอกาสในการใช้แนวทางการสรรหาประเภทเดียวกันกับที่มีอยู่แล้วในสิ่งมีชีวิตที่มียูคาริโอต

ในการพัฒนาระบบ iiT7 เราใช้การกลายพันธุ์ของ T7 RNA polymerase และการตัดทอนของโปรโมเตอร์ pt7 ชนิด wild-type เพื่อทำให้ความสามารถในการจับ DNA ของ T7 RNAP บกพร่อง ดังนั้นจึงแยกการรู้จำโปรโมเตอร์ของ T7 RNAP และฟังก์ชันการเริ่มต้นการถอดรหัสและทำให้สามารถจดจำโปรโมเตอร์ได้ ขึ้นอยู่กับโปรตีนการจับ DNA เสริม ได้ประสิทธิภาพการทำงานที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญโดยการแทนที่การหลอมรวมโควาเลนต์ระหว่างโดเมนการจับ DNA ด้วยปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนกับโปรตีน (ผ่านคู่ลิวซีนซิปของเรา) ซึ่งแยกกระบวนการจับ DNA ออกจากการเริ่มต้นการถอดรหัส และน่าจะช่วยอำนวยความสะดวกในการหลบหนีของโปรโมเตอร์และการยืดตัวถอดรหัส .

หลังจากทดสอบตัวแปรที่หลากหลายและเพิ่มประสิทธิภาพการทำงาน รูปแบบปัจจุบันที่ทำงานได้ดีที่สุดของระบบ iiT7 (ดังแสดงโดยแผนภาพมุมฉากในรูปที่ 3E) ประกอบด้วยสิ่งต่อไปนี้: โปรตีนฟิวชันหนึ่งตัวที่รวมโดเมนการจับ DNA ที่หลอมรวมกับลิวซีน ซิป (เช่น ZFA5-LZ2A) ฟิวชันโปรตีนตัวที่สองที่รวมลิวซีนซิปเปอร์ที่ถูกเลือกเพื่อสร้างปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนกับโปรตีนกับโครงสร้างแรกและหลอมรวมกับ T7 RNAP (เช่น LZ2B-T7) และโปรโมเตอร์ที่รวมเอาทั้งการจับดีเอ็นเอ เป้าหมายของอาร์เรย์ซิงก์ฟิงเกอร์และลำดับโปรโมเตอร์ T7 ที่ถูกตัดทอน (เช่น p1zfa5-d1) การเขียนโปรแกรมระบบ (การสร้างเป้าหมายใหม่) เกี่ยวข้องกับการแลกเปลี่ยนโดเมน ZFA และแทรกลำดับการจับ DNA ที่ตรงกันลงในโปรโมเตอร์ การปรับระดับของการเปิดใช้งานที่เป็นผลลัพธ์อาจทำได้โดยการเลือกโดเมน ZFA, โดเมน LZ หรือทั้งสองอย่าง จำนวนการเรียงสับเปลี่ยนที่พร้อมใช้งานสำหรับการปรับแต่งอาจควบคุมไม่ได้อย่างรวดเร็ว ดังนั้นคำแนะนำของเราสำหรับนักออกแบบที่ต้องการใช้ระบบ (โดยเฉพาะอย่างยิ่งหากทำงานโดยไม่มีไปป์ไลน์การคัดกรองปริมาณงานสูง) คือการเลือกคู่ LZ และปล่อยให้คงที่ในขณะที่สำรวจ ระดับกิจกรรมที่เกิดจากการเปลี่ยนแปลงเฉพาะโดเมน ZFA ที่เปลี่ยนไปเป็นโดเมน LZ สามารถนำเข้ามาได้ในภายหลังหากจำเป็น เพื่อปรับระดับกิจกรรม

ระบบ RNAP ที่มีฟาจเป็นพื้นฐานสององค์ประกอบนี้ในแบคทีเรียเริ่มคล้ายกับการถอดรหัสในยูคาริโอต โดยที่ปัจจัยการถอดรหัสจะคัดเลือก RNAP หลักไปยังโปรโมเตอร์ที่น้อยที่สุดที่มีกิจกรรมหรือความจำเพาะเพียงเล็กน้อยในการแยก น่าสนใจตรงที่เตรียมต้นฉบับนี้ Hillen และคณะ แสดงผ่านผลึกศาสตร์ว่า RNAP ของไมโตคอนเดรียของมนุษย์ (คล้ายคลึงกันของ T7 RNAP) ใช้กลไกที่คล้ายคลึงกันมากกับกลไกที่เราได้พัฒนาที่นี่ โดยที่ปัจจัยการถอดรหัสของยล TFAM แทนที่ ZFA ในระบบของเรา (70) TFAM และ mitochondrial RNAP โต้ตอบผ่านโดเมน alpha-helical คล้ายกับ leucine zippers ที่เราใช้เพื่อจุดประสงค์เดียวกันในระบบของเรา (รูปที่ S8 เสริม) เป็นการปลอบโยนที่ได้มาบรรจบกันโดยไม่ได้ตั้งใจบนวิธีแก้ปัญหาแบบเดียวกับวิวัฒนาการหลายพันล้านปี การบรรจบกันนี้ยังสามารถใช้เพื่อแจ้งทิศทางในอนาคตโดยแนะนำว่าการหลอมดีเอ็นเอยังสามารถแยกออกจากการถอดรหัสใน RNAP ได้อีก เนื่องจากปัจจัยการถอดรหัสของไมโตคอนเดรียที่สอง TFB2M ถือว่าบทบาทนี้ใน RNAP ของไมโตคอนเดรีย

ระบบ iiT7 นำเสนอวิธีการที่มีแนวโน้มดีในการขยายจำนวนของปัจจัยการถอดรหัสสังเคราะห์ที่มีอยู่ในบริบทของแบคทีเรีย ด้วยส่วนประกอบ ZFA และ LZ ที่รู้จักจำนวนมากซึ่งเป็นพื้นฐานสำหรับการสร้างโมดูลของไลบรารีส่วนประกอบมุมฉากที่ผู้ใช้เลือก ซึ่งแต่ละรายการมีความสามารถสูง กิจกรรมถอดความเมื่อรับสมัคร ด้วยการค้นหาเพิ่มเติมของพื้นที่การกลายพันธุ์ของ T7 พอลิเมอเรส อาจเป็นไปได้ที่จะพบการกลายพันธุ์ที่มีการออกฤทธิ์การถอดรหัสในกรณีที่ไม่มีองค์ประกอบใดๆ ของโปรโมเตอร์ T7 ดั้งเดิม ซึ่งจะทำให้ระบบง่ายขึ้น

พบความแตกต่างที่น่าสนใจในยูทิลิตี้ด้วยการกลายพันธุ์ T7 RNAP HEP การกลายพันธุ์นี้ ในขณะที่โดยทั่วไปเพิ่มการแสดงออกตามเป้าหมายจากโปรโมเตอร์ตามการตัดทอน d1 ของลำดับโปรโมเตอร์ pt7 (ยกเว้นการหลอมรวม ZFA1-T7(HEP)) จริง ๆ แล้วส่งผลให้มุมฉากโดยรวมลดลงเล็กน้อยเนื่องจากการเพิ่มขึ้นแบบสม่ำเสมอของ -กิจกรรมเป้าหมาย (รูปเสริม S9) ที่น่าสนใจ ข้อมูลเดียวกันแสดงให้เห็นว่ากิจกรรมที่ตรงเป้าหมายที่ไม่ดีของ ZFA1-T7(HEP) direct fusion ได้รับการกู้คืนในระบบ LZ-bridged ของระบบ: ZFA1-LZ2A + LZ2B-T7(HEP) มีเป้าหมายที่แข็งแกร่ง ในระดับเกือบเท่ากับรุ่นพี่ของมัน ZFA2-LZ2A + LZ2B-T7(HEP) การทำความเข้าใจความสัมพันธ์ระหว่างโดเมน ZFA และการโต้ตอบของโดเมนกับ RNAP ที่หลอมรวมและที่ผูกมัด จำเป็นต้องมีการตรวจสอบเพิ่มเติม

ทั้งโดเมนการจับดีเอ็นเอและโดเมนปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนกับโปรตีนที่ใช้ในที่นี้อาจถูกแทนที่ด้วยตัวแปรใหม่: เราได้สาธิตระบบเวอร์ชันที่ใช้ ZFA แล้ว แต่โดยหลักการแล้วโดเมนการจับดีเอ็นเอใดๆ สามารถนำมาใช้ได้ รวมถึงการถอดรหัส-ตัวกระตุ้น- เช่น (TAL) เอฟเฟกต์และ dCas9 การแยกเหตุการณ์ที่มีผลผูกพัน DNA ออกจากการจัดหาผ่านปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนกับโปรตีนเปิดโอกาสในการปรับหรือเปลี่ยนกิจกรรมของปัจจัยการถอดรหัสสังเคราะห์ผ่านวิธีการที่รู้จักจำนวนมากขึ้นของการปรับปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนกับโปรตีน รวมถึงการเหนี่ยวนำทางเคมีและการเหนี่ยวนำแสง ( 71, 72) สารเชิงซ้อน iiT7 แบบแยกส่วนสามารถสร้างขึ้นรอบๆ โครงสร้างโพลีนิวคลีโอไทด์และเปปไทด์โดยใช้โดเมนการจับที่จำเพาะแบบโมดาลิตี ซึ่งทำหน้าที่เป็นตัวตรวจจับ (73, 74) และยอมให้ปรับได้สำหรับการตอบสนองที่ไวเกิน (75) เป็นที่ทราบกันดีว่า T7 RNAP polymerase ทำงานในยูคาริโอต (34) ซึ่งเป็นการเปิดความเป็นไปได้ในอนาคตในการสร้างปัจจัยการถอดรหัสสังเคราะห์ที่สามารถทำงานได้ในโปรคาริโอตหรือยูคาริโอต แม้ว่างานจะยังคงต้องทำเพื่อพัฒนาการออกแบบ iiT7 อย่างเต็มที่ แต่นี่เป็นโอกาสที่ไม่เพียงแต่เพื่อทดสอบความเป็นสากลของหลักการออกแบบการถอดรหัสเท่านั้น แต่ยังรวมถึงการจำลองวิวัฒนาการตามธรรมชาติของ RNAP จาก phage T7 โดเมนเดียวแบบธรรมดาไปจนถึงโพลีเมอเรสแบบแยกส่วนและตั้งโปรแกรมได้ ของเซลล์ที่ซับซ้อน


หนังสือเรียน Canon: การแสดงยีนใด ๆ ในแบคทีเรีย - (ส.ค./09/2012 )

การทดสอบคร่าวๆ ของแผนที่พลาสมิดแสดงยีนดื้อยาปฏิชีวนะ แต่ยีนเหล่านี้มีโปรโมเตอร์หรือไม่ ถ้า (1) คือ "ใช่"

หัวข้อเกี่ยวกับการควบคุมการแสดงออกของยีนใช้โอเปอเรเตอร์เป็นตัวอย่าง ยีนยาปฏิชีวนะเหล่านี้เกิดจากสิ่งใดหรืออยู่ภายใต้การควบคุมใด ๆ หรือไม่?

ในตำราเรียน การไหลมักจะได้รับยีนที่น่าสนใจ โคลนยีน และเลือกแบคทีเรียที่มีพลาสมิดโดยใช้เครื่องหมายยาปฏิชีวนะหรือการแสดงออกของยีน แต่มันตรงไปตรงมาหรือไม่ได้กล่าวถึงรายละเอียด?

ฉันคิดว่ามีโพสต์ล่าสุดเกี่ยวกับยีนที่ไม่มีโปรโมเตอร์ที่นี่เช่นกัน และอีกคนหนึ่งเกี่ยวกับโปรโมเตอร์สองคน ทั้งสองทำให้ฉันสับสนมากขึ้น

ขอบคุณทุกคนที่จะอดทนแนะนำฉันผ่านสิ่งนี้

ยีนต้องถูกถ่ายทอดเป็น RNA จากนั้นจึงแปลเป็นโปรตีนเพื่อแสดง การถอดความถูกควบคุมโดยโปรโมเตอร์ 5' ของขอบเขตการเข้ารหัสของโปรตีน มีโปรโมเตอร์ 5' ของยีนต้านทานยาปฏิชีวนะในพลาสมิด โดยปกติแล้วสิ่งเหล่านี้เรียกว่าโปรโมเตอร์ที่เป็นส่วนประกอบ ซึ่งหมายความว่ายีนเหล่านี้มักมียีนดื้อต่อยาปฏิชีวนะบางชนิดซึ่งค่อนข้างเป็นพิษต่อเซลล์ และโปรโมเตอร์สำหรับสิ่งเหล่านี้บางครั้งสามารถเลือกได้เมื่อมียาปฏิชีวนะ แต่สิ่งนี้ค่อนข้างหายาก
พลาสมิดทั่วไปที่ใช้สำหรับการโคลนนิ่งมักจะมีโปรโมเตอร์ 5 และ 39 ของไซต์การโคลน ดังนั้นเมื่อบริเวณการเข้ารหัสยีนถูกแทรกเข้าไปในไซต์โคลน ยีนจะแสดงออกมา โปรโมเตอร์เหล่านี้บางตัวเหนี่ยวนำไม่ได้ กล่าวคือ สามารถเปิดและปิดได้ขึ้นอยู่กับสารเคมีบางชนิด เช่น IPTG หรืออะราบิโนส หวังว่านี่จะช่วยได้

1) ในการถ่ายทอดยีน คุณต้องมีโปรโมเตอร์สำหรับ RNA polymerase เพื่อจับและผลิต mRNA (ขึ้นอยู่กับโปรโมเตอร์ คุณอาจต้องมีเทอร์มิเนเตอร์ด้วย) บน mRNA ที่คุณต้องการต้นน้ำ codon เริ่มต้น rbs (ไซต์การจับไรโบโซม ) เพื่อให้ไรโบโซมจับและแปลผลในโปรตีนของคุณ คุณต้องดูแลว่าต้นกำเนิดหรือการจำลองแบบ (เพื่อเพิ่มจำนวนพลาสมิดภายในแบคทีเรีย) โปรโมเตอร์และ rbs นั้นจำเพาะสำหรับแบคทีเรียถ้าใช้แบคทีเรียในการแสดงออกหรือยีสต์ถ้าคุณใช้ยีสต์ ฯลฯ เป็นไปได้ที่พลาสมิดมี ต้นกำเนิดของการจำลองแบบสำหรับแบคทีเรียเพื่อให้คุณสามารถโคลนในแบคทีเรีย และต้นกำเนิดของการจำลองแบบอื่นสำหรับยีสต์ เพื่อให้คุณใช้พลาสมิดสำหรับการแสดงออกของยีสต์
2) ดูคำตอบข้างต้นพร้อมส่วนเสริมว่า หากคุณมีการดื้อยาปฏิชีวนะ คุณต้องตรวจสอบว่าเชื้อโปรโมเตอร์นั้นจำเพาะกับสิ่งมีชีวิตใด เช่น ฉันมีพลาสมิดที่ให้การดื้อยาแอมพิซิลินในแบคทีเรีย และการดื้อยาเจนตามิซินเมื่อใช้กับการติดเชื้อไวรัสในเซลล์แมลง . ในทางกลับกัน แม้ว่าการดื้อยาเจนตามิซินจะมีอยู่ที่พลาสมิด แต่ในแบคทีเรีย สิ่งนี้ไม่ทำให้เกิดการดื้อยาเจนตามิซิน เนื่องจากโปรโมเตอร์นั้นจำเพาะสำหรับการแสดงออกของเซลล์แมลง
3) ดูคำตอบก่อน
4) โดยฟีโนไทป์คุณกำลังพูดถึงการแสดงออกของโปรตีนหรือไม่? โดยปกติการแสดงออกของยีนต่างประเทศจะไม่ให้ฟีโนไทป์อื่นนอกจากการแสดงออกของโปรตีนและการเจริญเติบโตช้าลง บางครั้งฉันมีฟีโนไทป์เมื่อฉันแสดงโปรตีนที่เชื่อมโยง DNA/RNA เพราะมันจับ DNA และ RNA อิสระทุกตัวและกลายเป็นพิษต่อเซลล์ หากคุณกำลังอ้างถึงการแสดงออกของโปรตีนเป็นฟีโนไทป์ มันไม่ง่ายอย่างที่ปรากฏในกระดาษ แต่เพื่อตอบคำถามของคุณ คุณไม่จำเป็นต้องเพิ่มโปรโมเตอร์ เวกเตอร์จะมาพร้อมกับโปรโมเตอร์ก่อนไซต์โคลนหลายไซต์ ซึ่งคุณต้องแทรกยีนที่คุณสนใจ มีรายละเอียดบางอย่างที่ผู้คนพลาดแล้วเกิดปัญหาขึ้น ตัวอย่างเช่น เพื่อให้ข้อมูลพื้นฐานแก่คุณเท่านั้น:
ก) มีการโคลนสายพันธุ์แบคทีเรีย เช่น DH5alpha หรือ XL1Blue ซึ่งไม่มีเอ็นโดนิวคลีเอส/รีคอมบิเนสที่จำเพาะซึ่งทำให้เหมาะสมในการดึงดีเอ็นเอในปริมาณที่มากขึ้น คุณใช้สายพันธุ์เหล่านี้เพื่อเปลี่ยนปฏิกิริยา ligation ของคุณเพื่อให้ได้พลาสมิดสุดท้ายของคุณ เติบโตช้า
มีสายพันธุ์การแสดงออกเช่น BL21 ซึ่งไม่มีโปรตีเอสจำเพาะเพื่อให้โปรตีนที่แสดงออกของคุณไม่เสียหาย เปลี่ยนพลาสมิดที่ได้มาก่อนหน้านี้เป็นสายพันธุ์เหล่านี้และใช้สำหรับการแสดงออก
c) มี BL21 อีกแบบหนึ่งที่เรียกว่าโกลด์ซึ่งมีทั้งข้อดีคือไม่มีเอ็นโดนิวคลีเอส/รีคอมบิเนสและเหมาะสำหรับการแสดงออกซึ่งนำไปสู่ความเป็นไปได้ในการเปลี่ยนปฏิกิริยา ligation ไปเป็นสายพันธุ์นี้โดยตรงและข้ามขั้นตอน DH5alpha/Xl1Blue
d) หากคุณกำลังทำงานกับเวกเตอร์ pET (มีโปรโมเตอร์ T7) คุณต้องทำงานกับสายพันธุ์การแสดงออกที่มี (DE3) ในชื่อ (หมายความว่าพวกเขาสามารถแสดง T7 RNA polymerase ที่รู้จักโปรโมเตอร์นี้)
จ) มีหลายกรณีที่แม้ว่าคุณจะโคลนทุกอย่างถูกต้อง แต่โปรตีนของคุณไม่แสดงออกหรือส่งผลให้มีการรวมตัวหรือถูกพับผิดและแยกส่วนภายในแบคทีเรีย ในกรณีเหล่านี้ คุณต้องทดสอบสายพันธุ์การแสดงออกที่แตกต่างกัน เวกเตอร์ที่ต่างกันด้วยโปรโมเตอร์ที่มีจุดแข็งต่างกัน อุณหภูมิการแสดงออกต่างกัน สื่อต่างกัน ป้าย N-terminal ต่างๆ ที่ส่งเสริมการพับ ชิ้นส่วนของโปรตีนต่างกันเนื่องจากโปรตีนที่ใหญ่กว่า 50 kDa ในแบคทีเรียนั้นแสดงออกได้ยาก (บางคนบอกว่ามากกว่า 27 kDa)

The thing with two/multiple promoters is that there are vectors that are made in such a way that you can use them for expression in different organisms i.e. E coli and insect cells without needing to reclone the gene by having two promoters one after the other such that when in bacteria the RNA polymerase recognizes the bacterial promoter, when in insect cells, the insect cells RNA polymerase recognizes the insect cell promoter. i.e. pTriEX from Novagen,

What you have asked is an entire field of expertise. If this would be easy to explain in 1-2 pages, I wouldn't be needed in my job:) I could suggest some material for reading such as Unit 5.24 from Current Protocol in Protein Science: Strategies to Optimize Protein Expression in E. coli by DM Francis and R. Page. If you cannot access it from your lab, drop me a message with your email address and I will send it to you.

Thank you very much phage434 and ascacioc. I was reading about molecular biology to prepare ahead of my final year. I understand that I am still a long way out and I appreciate your taking the time to explain. Could not really sleep with so many question marks floating about but I am happy to put some of these away.

Just to note here: when I mentioned "phenotype", I was thinking along the line of a new "characteristics" conferred by the new gene. Maybe that was inaccurate and I got mixed up with Drosophila genetics The PET system is fascinating (first impression) but I am not looking to make so many proteins. Just mutant bacterial clones.

Going forward I am sure I will have more questions and I will try to find out the answers by myself first.

To just make a quick note on the phenotype thing: If you are refering to a particular characteristic confered by the gene: if you have a type of cell (bacteria, yeast, mamalian cell line) that is a mutant of a gene (deletion mutant), you can make a rescue experiment using a plasmid containing the gene you deleted from the chromosome. This means that the protein will be expressed from the plasmid and will make the cell healthy (behaving like wild type) again. Plasmids are not only for expression of proteins for purification towards biochemical analysis.

Yes, T7 promoters come from the T7 bacteriophage. Studier, who according to me is the father of cloning, has characterized the bacteriphage many years ago and came up with the idea of pET system. He did also other wonderful things in cloning and protein expression like the autoinduction media. If you have time, you could look up what other contributions he did to the field of cloning.

Indeed, there are many bacterial hosts. What I find important to know is to know what a K strain (cloning strain) and a B strain (expression strain) are. Also, if you start using them, you could start learning the genotyping codes. A strain comes with a certain genotype i.e. mutations and insertions of genes, which make it different to other strains. Basically, at this level you need to read only 1-2 lines of genotype code and be able to tell what is the use of this strain. But this is expert level. A good webpage for this is: http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes But again, this is knowledge you have in your mind when you do only this for many years. Nobody will expect you to know these things (most of the PhD students around me are happy without even knowing that this wiki exists)

Your questions:
1) Good question. ไม่เคยคิดเกี่ยวกับมัน When I have seen it this morning, I was like: why would you do this? But just for theoretical purposes (even though, I am not 100% sure about what I am saying next): I think that the gene will be transcribed from both promoters i.e. once by RNA polymerase binding to one promoter and another time by binding to the other promoter. On the other hand, it will be crowded in this area and this might lead to slowing down or to shorter mRNA fragments because I imagine that if the first RNA polymerase binds on the upstream promoter and there is also another RNA polymerase downstream, the the first one stumbles accross the second one and cannot continue would wait a while until it cannot move anymore and then detach. Anyhow, we do not do that
2) http://www.amazon.com/Molecular-Cloning-Laboratory-Manual-Edition/dp/0879695773/ref=pd_sim_sbs_b_1 This the the bible of molecular cloning. However, nobody buys this for their own (check the price). Each good lab has a copy. I learn usually from internet, like wikis. The companies that sell the strains/vectors have also good material e.g Novagen. Also, there is a good journal, low impact factor, but specific for this fiels: Journal of Protein Expression & Purification. I check it regularly for new things in the field (generally there are tricks you can learn from how people dealt with their specific protein). Also there is a series of protocols: Current Protocols in Protein Science, or Current Protocols in Molecular Biology. They are written book style but they are mainly online. Actually, this is a field that, in my opinion is based on knowledge, not experience. There is a certain practical experience one needs, but if one lacks the basic knowledge of what is what, he can do the same mistake over and over again.

Yes, been going from one page to another in openwetware.org. Some things make sense and others are totally foreign. Same goes for the genotype notation am looking at Biobricks at the moment and already scratching my head.

Thank you so much for the explanations, Andreea. ฉันขอขอบคุณที่.

A note on the two promoters situation (I asked a friend yesterday over lunch about this intersting question of yours and she had some additions):
-in the consideration that you are using a vector with its own promoter to clone a gene with natural promoter, and the gene is from the same organism as the vector is i.e. both promoters are recognized by the RNA polymerase that is present in the host, you get a mixture of mRNAs that have the following structure . vector promoter - vector rbs - original promoter - original rbs - AUGgene. and . original promoter - original rbs - AUGgene. (rbs = ribosome binding site).
-the rbs is not a precise sequence, it is 6 consequent nucleotides enriched in As and Gs. Moreover, it is 6-8 bases upstream of the AUG
-in the second construct everything is fine
-in the longer construct (which is most probably the abundant one since expression vector promoters are the strongest found in nature to make your host express mostly your protein) you have a different story: there is a long strand of nucleotides from the 5' end up to the original rbs (the right one for the right AUG) that might be, coincidently, detected as a rbs (the odds are that there are a lot of 6 consecutive A/Gs) and then the ribosome will look for a AUG donwstream the fake rbs and start translation. Again the odds are that there are other AUGs out of frame in this long extra strand of nucleotides. This might lead to the wrong protein being translated.

This is why we do not do this:) We don't like to gamble. If we want the original promoter (which sometimes is the case), we clone the gene with the promoter in such a way to get rid of the original promoter in the vector. If we do not insist on the natural promoter (which anyhow is a weak one, most of them are), we clone only the gene.

A little bit hijacking this topic, but if I understand it correctly there are 2 vectors: expression vectors and cloning vectors (or strains).

The cloning vectors are vectors that provide the possibility to clone (duplicate the plasmid?) the genes you want (stable transfer of the plasmid during cell division?). I assume these are high copy vectors and vectors that maintain the plasmid very stable in high copy numbers?
While expression vectors are vectors that provide everything for a stable expression, translation?

But what are the molecular differences between those? I noticed you mentioned the the lack of proteases in expression strains and the lack of endonucleases/recombinases in cloning vectors, but are there other specific differences?
(eg: high copy in cloning vs low copy in expression? Or a very strong promoter in the exrepssion vectors?).

There are 2 strains you use for the same vector: cloning strain (K strain e.g. DH5alpha, XL1Blue) is the one with mutant dnases and recombinases and expression strain (B strain e.g BL21, Rosseta etc) is the one with mutant proteases.
In the K strain your ligated plasmid would be nicely transformed since there are minimum dnases and recombinases to affect it. These strains grow slow but have great transformation efficiency. They are also very easy to make competent using the Hanahan method which was actually developed for K strains. These strains are used mainly for plasmid production for mini/midi preping.
In the B strain, your protein will be nicely expressed and protected from the proteases, so it can accumulate up to the harvest time. Minimum preoteases to chop your protein up. Grow faster but have terrible transformation efficiency.
The story behind the original B-strains and K-strains is long. Initially, they were doing this old fashion UV-mutation/selection for the nice bacterial strains that people wanted to have. So they obtained strains to suit them but with lots of mutations. Hence, there are quite a few differences on the genome level between the strains. For more details, I recommend:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19765592 (as I said, Studier writes all the nice articles )
The normal workflow from gene to protein in bacteria: PCR your insert with overhangs for the restriction enzymes you want to use restrict digest the vector and the insert with these enzymes ligate vector and insert transform in K strain and plate check the ontained colonies for the right insert by colony PCR miniprep a few of them and send for sequencing once sequence confirmed, transform the plasmid in B-strain and do the expression of your protein in the B-strain.

Now, this is the classical way (details omitted for simplicity do not take it as a protocol there are some steps in between that are essential such as PCR clean up. ). If you for example want to transform an epPCR library or any kind of library of variants and select based on expression of your protein, then you cannot wait to obtain the plasmid from K strain, you have to go directly to the B-strain. So, in this case, due to the fact that nowadays we have a bit of more knowledge of how to manipulate bacteria, beyond UV, people have modified the classical BL21(DE3) to get BL21-Gold(DE3) (and similar strains) which has the advantage that it is also a mutant of endonucleas A (as K strains are, but this one is done nicely with modern molecular biology methods not UV ) Now, you will be tempted to say, hack, why should I use the long way and not transform the ligation directly to BL21(DE3)-Gold? Well, you could do that, but I personally do not like strains with too many mutations (endonuclease A is needed in the bacteria) because they are not too healthy and stressed bacteria do not produce tons of protein. But this is just me.

Another question that might arise would be: why do you go through K-strain until the expression strain:
1- easy to transform ligation reaction into if you use BL21(DE3) for transforming you might end up with no clones, but you might also be lucky. The question is: do you want to play the lotery in the lab?
2 - easy to mini/midiprep your plasmid to have enough for sequencing or other things for which you need ug amounts. Again, nobody says you cannot miniprep from BL21, but you need to be good at. I minipreped successfully from B strains, but I am a mixture of luck and good hands:) I have seen people not being able to miniprep from B-strains. So again: how lucky do you feel to do that? You might end up repeating the entire cloning procedure because you were too lazy to go through the K-strain. (we have a saying in my language: the lazy one, runs more I thought appropriate to insert some wisdom from the elders here )

This was the story about the strains = living organisms that multiplicate on their own. Not to be confused with plasmids: round pieces of DNA that is not able to multiply on its own. For simplicity, I will refer from now own only to bacterial plasmids, even though the parts are common for many other plasmids.
In a plasmid you generally have:
-origin of replication - needed by the bacteria to recognize the plasmid for replication these origins are that thing that give the copy number you can have high copy number plasmids (100 copies per cell) or low copy number plasmids (1-10) this is regulated by the origin of replication. In general, for expressing proteins, you want a low copy number plasmid. But for cloning in bacteria a plasmid to be used for mammalian cell culture imaging or for yeast protein expression, basically to be used in another organism, then you use a high copy number plasmid.
-antibiotic resistance - with its own constitutive promoter and terminator produces protein to clear the antibiotic makes the bacterium survive in the certain antibiotic used for selection
-promoter - used for transcription of mRNA from your insert
-terminator -stops mRNA transcription
-rbs - ribosome binding site - ribosome recognition site for translation to happen
-MCS - multiple cloning site with various restriction sites for you to put your insert into
These are the minimum components you have on an expression vector in bacteria. On top, you have some other regulatory components. But this is advanced molecular biology I will let you discover on your own

Hi carlmartin and Andreea,

Am I correct in saying that since we don't want to "gamble" with the outcome , it also follows that when one wishes to express a protein, it is crucial that the 'thing' downstream of the promoter be an ORF? Or else, we'll have a situation similar to the two-promoter scenario in our hands.

lyok on Sat Aug 11 09:22:22 2012 said:

I could be wrong but I understand both การโคลนนิ่ง และ expression vectors as genetic elements independent of their copy number. While the term expression vector seems to bring to mind a vector used for the overproduction of proteins for purification, a cloning vector can be an 'expression' vector by virtue of it having a promoter (err. right?).

In a rescue / complementation experiment, I believe that plasmids such as the pUC or pGEM with their respective promoters and being in the right environment would be expressed and restore the host.

As for stability and maintenance, it does appear to me in the beginning that high copy number is more superior to low copy one but after some digging found that the latter can be stably maintained too.

ascacioc on Sat Aug 11 10:32:24 2012 said:

I guess certain things are just like that . Brings to mind a discussion I had a while back with someone here regarding copy number and the resulting mRNA and protein but that's for another topic.


Supporting Information

รูปที่ S1

Expression of eYFP-NLS decreases as the space between the promoters increases. Western blot probed with anti-GFP. The levels of eYFP-NLS expression were normalised against the BiP loading control. Two independent clones of each plasmid were examined and the percentage of cells fluorescent after induction is shown.

รูปที่ S2

Flow cytometry analysis of Lister 427 pSPR2.1 p3227 and Lister 427 p3383. Two independent clones of each cell line were analysed with the typical result presented here. Red line untransformed Lister 427 pSPR2.1, black line uninduced, green line 18 hours tet induction.

ตาราง S1

Table describing inducible tagging plasmids produced.

ตาราง S2

Table describing plasmids used in this study. pLEW100 is described in Wirtz et al. [2]. p2948 and pDEX377 are described in Kelly et al. [8].

ตาราง S3

DNA sequences of all the plasmids used in this study.


Associated Data

Designing and building multigene constructs is commonplace in synthetic biology. Yet functional successes at first attempts are rare because the genetic parts are not fully modular. In order to improve the modularity of transcription, we previously showed that transcription termination in vitro by bacteriophage T7 RNA polymerase could be made more efficient by substituting the standard, single, TΦ large (class I) terminator with adjacent copies of the Vesicular Stomatitis Virus (VSV) small (class II) terminator. However, in vitro termination at the downstream VSV terminator was less efficient than at the upstream VSV terminator, and multigene overexpression in vivo was complicated by unexpectedly inefficient VSV termination within อี. โคไล เซลล์. Here, we address hypotheses raised in that study by showing that VSV or preproparathyroid hormone (PTH) small terminators spaced further apart can work independently (i.e. more efficiently) in vitro, and that VSV and PTH terminations are severely inhibited in vivo. Surprisingly, the difference between class II terminator function in vivo versus in vitro is not due to differences in plasmid supercoiling, as supercoiling had a minimal effect on termination in vitro. We therefore turned to TΦ terminators for 𠇋ioBrick” synthesis of a pentameric gene construct suitable for overexpression in vivo. This indeed enabled coordinated overexpression and copurification of five His-tagged proteins using the first construct attempted, indicating that this strategy is more modular than other strategies. An application of this multigene overexpression and protein copurification method is demonstrated by supplying five of the six อี. โคไล translation factors required for reconstitution of translation from a single cell line via copurification, greatly simplifying the reconstitution.


Competent Cell Selection Guide

There are many properties to consider when choosing a strain for your experiments. Requirements such as plasmid preparation, blue/white screening, cytoplasmic disulfide bond formation, and fast colony growth necessitate specific strain choices. The following selection chart highlights the characteristics and formats of NEB&rsquos strains to help select the optimal strain for a particular experiment. The free online tool, NEBcloner can also be used to help select competent cells. For more information, please visit Cloning Competent Cell Strains or E.coli Expression Strains.

CAUTION: Chemically Competent E. coli contain DMSO, a hazardous material. Review the MSDS before handling.

Cloning Strain Properties

  • Dam/Dcm methyltransferase free plasmid growth
  • Fastest growth &ndash colonies visible after 6.5 hours
  • Plasmid preparation after 4 hours
  • Versatile cloning strain
  • DH5&alpha&trade derivative
  • Toxic gene cloning
  • F´ strain with extremely high transformation efficiency
  • Large plasmid and BAC cloning
  • DH10B&trade derivative
  • Cloning unstable inserts
  • Isolating and propagating retroviral/lentiviral clones
  • Ideal for subcloning efficiency transformations, such as plasmi transformation or routine subcloning

Protein Expression Strain Properties

  • Versatile non-T7 expression strain
  • Protease deficient
  • Routine T7 expression
  • Tunable T7 expression for difficult targets
  • Improved purity of target proteins isolated by IMAC
  • Routine non-T7 expression
  • Most popular T7 expression strain
  • Protease deficient
  • T7 expression
  • Protease deficient
  • Better reduction of basal expression
  • T7 expression
  • Protease deficient
  • Highest level of expression control
  • T7 expression/K12 strain
  • Enhanced capacity to correctly fold proteins with multiple disulfide bonds in the cytoplasm
  • Protease deficient/B strain
  • Enhanced capacity to correctly fold proteins with multiple disulfide bonds in the cytoplasm
  • T7 expression
  • Protease deficient/B strain
  • Enhanced capacity to correctly fold proteins with multiple disulfide bonds in the cytoplasm
  • T7 expression
  • Protease deficient/B strain
  • Tightly controlled expression of toxic proteins
  • Enhanced capacity to correctly fold proteins with multiple disulfide bonds in the cytoplasm
  • Control of IPTG induced expression from Pแลค, Pแทค, Ptrc and T5แลค
  • Protease deficient

(1) Rhamnose solution is provided instead of SOC control plasmid is included.
(2) Important for high-quality plasmid preparation.
(3) Lacks Lon and OmpT protease activity.
(4) Constitutively expresses a chromosomal copy of the disulfide bond isomerase DsbC.
(5) nit = nitrofurantoin, tet = tetracycline, cam = chloramphenicol, str = streptomycin, spec = spectinomycin
(6 )Resistance to low levels of streptomycin may be observed.
(7) Legend 50 = 50 µl tubes 200 = 200 µl tubes 96 = 96 well plate 384 = 384 well plate strips = 96 tube strips (50 µl/tube) 400 = 400 µl tubes
(8) 1-5 x 10 8 for R-format.
(9) 1-3 x 10 8 for P-format.


Characterization

เค้าร่าง

1) Expression of different proteins: monitoring growth

2) Expression of proteins with our backbone before and after optimization

3) SDS-PAGEs for the expression assay over the time of Full Construct (BBa_K3037003)

4) Image analysis of the expression in the SDS-PAGEs with ImageJ

Experiments in Detail

1) Expression of different proteins: monitoring growth

To evaluate the impact on the metabolic burden of over-expressing proteins, we tested different constructs cloned into our backbone. For this we used: HRP (BBa_K3037007) and our full construct (BBa_K3037003). After cloning, the constructs were expressed in E. coli pRARE T7 and we monitored growth over time (Figure 2). Induction of the system was performed after 165 min with 1 mM IPTG. Overall, the results prove that when expressed, none of our proteins inhibit growth.

2) Expression of proteins with our backbone before and after optimization

To use this backbone as convenient expression vector in iGEM, we had to include the Prefix and Suffix of the BioBrick Assembly. Subsequentially, we compared the expression of the original vector we recieved, pOCC97, to our optimized version for iGEM, BBa_K3730000.

We found that the original plasmid (= non-optimized) had a XbaI site, which we used to insert our BioBrick BBa_K3037003. This ilegal restriction site was later removed with an overhang PCR. The original XbaI restriction site was positioned downstream of the T7 polymerase promoter and upstream the RBS sequence of the plasmid. This way only BioBricks that already has a RBS fused to them could be expressed. Since we were using the RFC25 standard of Freiburg for our fusion proteins, the inserted protein contained already its own RBS in the Prefix.

However, we experienced on our own how difficult it is to add such a small sequence, as an RBS, to our other constructs. Therefore we redesigned the plasmid to be ready for expression in a single digestion+ligation reaction. We removed the XbaI restriction site and included a Prefix and Suffix of the RFC 10 standard after the RBS of the plasmid (=optimized).

We used the BioBrick assembly method to insert our BioBrick BBa_K3037003, which also has its own RBS due to the RFC25 standard.

In Figure 3, we show the expression of the protein BBa_K3037003 using both plasmids optimized (left) and non-optimized (right) and also different IPTG concentrations for induction and temperature.


The comparison of the growth curves shows that, the new plasmid adapted to the RFC 10 standard did not affect the growth, as it shows similar behavior compared to the original one (Figure 4).

3) SDS-PAGEs of the expression assays of the full construct (BBa_K3037003)

Down below follow several SDS-PAGEs of loaded crude cell extract (all normalized to an OD of 0.5) harvested at different time points pre- and post-induction. Used IPTG concentrations are indicated. Arrows indicate predicted size of the protein of interest.

Comparison of the expression of MBP-HRP (BBa_K3037008) and Full Construct (BBa_3037003)

Expression of full construct in pOCC97 not optimized at 18ºC

Expression of Full Construct in pOCC97 at 37ºC

Expression of Full Construct in pOCC97 optimized

4) Image analysis of the expression in the SDS-PAGEs with ImageJ

The previously shown SDS-pages were then further analysed by using the software ImageJ to correct for loading differences and be able to draw conclusions about the best conditions to express the Full Construct in pOCC97.


Temperature and IPTG induction dependence of the optimized pOCC97

Temperature and IPTG induction dependence of the not optimized pOCC97

Comparison between optimized and not optimized pOCC97


Based on this analysis, it can be concluded that optimal conditions for the expression of our fusion protein, BBa_3037003, is an overnight expression at 18ºC and inducing with 0.5 mM IPTG. We are proud to say that our optimized pOCC97 shows an increased expression and robustness under various conditions tested.


ดูวิดีโอ: T7 Promotor. T7 Promotor In pET Plasmid. pET Vector (มกราคม 2022).