ข้อมูล

ใน PCR สารเคมีของไพรเมอร์คืออะไร? ดีเอ็นเอหรืออาร์เอ็นเอ?


ฉันคิดว่าคำตอบคืออาร์เอ็นเอ นั่นถูกต้องใช่ไหม?


ดีเอ็นเอเกือบตลอดเวลา แม้ว่า RNA จะเป็นไปได้ แต่การสังเคราะห์ (และคงความเสถียรไว้) นั้นยากกว่ามาก และ DNA ส่งผลให้เกิดผลลัพธ์ DNA ล้วนๆ ซึ่งไม่จำเป็นต้องถูกแทนที่ด้วย DNA ในภายหลัง


ไพรเมอร์ PCR เป็นชิ้นสั้นของ ดีเอ็นเอสายเดี่ยวโดยปกติแล้วจะมีความยาวประมาณ 20 นิวคลีโอไทด์

คุณสามารถอ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับ PCR ได้ที่ Khan Academy หรือ Wikipedia


อณูชีววิทยา- คำถาม Viva- ชุด -1

ในโมเลกุลดีเอ็นเอ ความเข้มข้นของดีออกซีอะดีโนซีน (A) นิวคลีโอไทด์เท่ากับนิวคลีโอไทด์ของไทมิดีน (T) (A = T) ในขณะที่ความเข้มข้นของดีออกซีกัวโนซีน (G) นิวคลีโอไทด์เท่ากับนิวคลีโอไทด์ดีออกซีไซติดีน (C) นิวคลีโอไทด์ (G = C)

2- hyperchromicity ของ denaturation หมายถึงอะไร?

พันธะคู่ที่ผสานกันของอนุพันธ์ purine และ pyrimidine ดูดซับแสงอัลตราไวโอเลต ผลการกลายพันธุ์ของแสงอัลตราไวโอเลตเป็นผลมาจากการดูดซึมโดยนิวคลีโอไทด์ใน DNA พร้อมกับการเปลี่ยนแปลงทางเคมี ในขณะที่สเปกตรัมขึ้นอยู่กับ pH ที่ pH 7.0 นิวคลีโอไทด์ทั่วไปทั้งหมดจะดูดซับแสงที่ความยาวคลื่นใกล้กับ 260 นาโนเมตร เมื่อโมเลกุล DNA เสื่อมสภาพ จะเกิดการดูดกลืนแสงของเบสพิวรีนและไพริมิดีนเพิ่มขึ้น ซึ่งเป็นปรากฏการณ์ที่เรียกว่า hyperchromicity ของการทำให้เสียสภาพ ในรูปแบบที่ถูกผูกไว้จะมีการดูดกลืนน้อยลง

3- กำหนดการผสมพันธุ์

การเชื่อมโยงใหม่อย่างจำเพาะของกรดนิวคลีอิกที่เสริมกัน (DNA with DNA, DNA with RNA หรือ RNA with RNA) เรียกว่าการไฮบริไดเซชัน

4-โครงสร้างกิ๊บคืออะไร?

การยืดแบบเกลียวคู่ที่เกิดขึ้นจากการจับคู่ฐานระหว่างลำดับเสริมที่อยู่ใกล้เคียงของ DNA หรือ RNA เส้นเดียวนั้นแสดงโดยโครงสร้างกิ๊บ

5- อะไรคือเหตุผลที่ข้อมูลทางพันธุกรรมถูกเก็บไว้ใน DNA ไม่ใช่ใน RNA?

DNA เป็นโมเลกุลที่เสถียรเมื่อเปรียบเทียบกับ RNA ไม่มีการย่อยสลายตามธรรมชาติ ดังนั้นจึงเป็นคลังข้อมูลทางพันธุกรรมและถ่ายโอนข้อมูลทางพันธุกรรมไปยังเซลล์ลูกสาวด้วยความถูกต้องและเที่ยงตรงอย่างสมบูรณ์

6- อะไรคือความแตกต่างระหว่าง Uridine และ pseudouridine?

ทั้งสองเป็นนิวคลีโอไซด์ ใน uridine Uracil เชื่อมโยงกับ D-ribose โดยการเชื่อมโยง β- N glycosidic ในขณะที่ Pseudouridine Uracil เชื่อมโยงกับ D-ribose โดยการเชื่อมโยง C-C ซึ่งไม่ใช่การเชื่อมโยงที่แท้จริง

7- ยกตัวอย่างของ DNA polymerase ที่ขึ้นกับ RNA

ทรานสคริปเทสและเทโลเมอเรส

8- ให้ตัวอย่างของ DNA polymerase ที่ขึ้นกับ DNA

DNA polymerase ทั้งหมดที่จำเป็นสำหรับการจำลองแบบ

9- ให้ตัวอย่างของ DNA ที่ขึ้นอยู่กับ RNA polymerase

RNA polymerase ที่จำเป็นสำหรับการถอดรหัส

10-กำหนดเทมเพลต

แม่แบบเป็นพื้นผิวนำทางซึ่งโมเลกุลจะเรียงตัวกันในลักษณะเฉพาะของลำดับเพื่อสร้างโมเลกุลชีวโมเลกุลที่มีการจัดเรียงส่วนประกอบที่เฉพาะเจาะจงและกำหนดไว้

11- การเริ่มต้นของการสังเคราะห์ DNA ต้องใช้ไพรเมอร์ (priming โดยความยาวสั้นของ RNA) เหตุผลคืออะไร?

DNA polymerase ไม่สามารถเริ่มต้นการสังเคราะห์ลูกโซ่ได้ แต่สามารถยืดส่วนที่มีอยู่ออกไปได้ นั่นคือสาเหตุที่จำเป็นต้องใช้ไพรเมอร์ RNA polymerase สามารถเริ่มการสังเคราะห์ลูกโซ่ ซึ่งเป็นสาเหตุที่ไพรเมอร์ประกอบด้วย RNA เสมอ

12- เอ็นโดนิวคลีเอสคืออะไร?

เอ็นโดนิวคลีเอสเป็นเอ็นไซม์ที่แยกพันธะภายในใน DNA หรือ RNA

13- อะไรคือความแตกต่างระหว่าง exonuclease และ exonuclease?

Exonuclease เป็นเอนไซม์ที่แยกนิวคลีโอไทด์ออกจากปลาย DNA หรือ RNA 3′ หรือ 5′

เอ็กโซนิวคลีเอสคือ NSการตัดนิวคลีเอสที่เกี่ยวข้องกับการซ่อมแซมการแลกเปลี่ยนนิวคลีโอไทด์ของดีเอ็นเอ

14- อินตรอนคืออะไร?

อินตรอนคือลำดับของยีนที่คัดลอกมาแต่ถูกตัดออกก่อนการแปล

15- ligation หมายถึงอะไร? ตั้งชื่อเอนไซม์ที่เป็นตัวเร่งกระบวนการนี้

การรวมตัวเร่งปฏิกิริยาด้วยเอนไซม์ในการเชื่อมโยงฟอสโฟไดสเตอร์ของ DNA หรือ RNA สองสายในหนึ่งเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องคือ DNA และ RNA ligases

16. ต้นกำเนิดของการทำซ้ำหมายถึงอะไร?

ต้นกำเนิดของการจำลองแบบคือไซต์บน DNA ซึ่งเป็นจุดเริ่มต้นของกระบวนการจำลองแบบ ที่ ที่มาของการจำลองแบบ (ori) มีความสัมพันธ์กันของโปรตีนที่จับกับ dsDNA เฉพาะลำดับกับชุดของลำดับ DNA ที่ทำซ้ำโดยตรง ในโปรคาริโอต มีต้นกำเนิดเดียวของการจำลองแบบในขณะที่ในยูคาริโอต มีต้นกำเนิดหลายแหล่งเนื่องจากความยาวมหาศาลของดีเอ็นเอ

17- ลำดับ palindrome คืออะไร?

ลำดับของ duplex DNA ที่เหมือนกันเมื่ออ่านทั้งสองเส้นในทิศทางตรงกันข้าม

18- ไพรเมอร์ไพรเมอร์และพรีโมโซมต่างกันอย่างไร?

ไพรเมอร์เป็นส่วนสั้นๆ ของอาร์เอ็นเอที่จำเป็นสำหรับการจำลองดีเอ็นเอ พรีเมสเป็นเอนไซม์ที่ทำหน้าที่สังเคราะห์ไพรเมอร์ เป็น RNA polymerase ชนิดพิเศษ พรีโมโซมคือ คอมเพล็กซ์เคลื่อนที่ของเฮลิเคสและไพรเมสที่เกี่ยวข้องกับการจำลองดีเอ็นเอ

19- โพรบคืออะไร?

โพรบคือโมเลกุลที่ใช้ในการตรวจหาการมีอยู่ของชิ้นส่วนเฉพาะของ DNA หรือ RNA ตัวอย่างเช่น อาณานิคมของแบคทีเรียที่สร้างขึ้นจากคลังพันธุกรรมหรือในระหว่างการวิเคราะห์โดยเทคนิคการถ่ายโอน blot โพรบทั่วไปคือโมเลกุล cDNA, โอลิโกดีออกซีนิวคลีโอไทด์สังเคราะห์ที่กำหนดไว้ ลำดับหรือแอนติบอดีต่อโปรตีนจำเพาะ

20- อะไรคือความแตกต่างระหว่างยีนที่เป็นส่วนประกอบและยีนที่เหนี่ยวนำไม่ได้?

หนึ่ง ยีนเหนี่ยวนำ เป็นนิพจน์ที่เพิ่มขึ้นในการตอบสนองต่อ an ตัวกระตุ้น หรือ ตัวกระตุ้น, สัญญาณการกำกับดูแลเชิงบวกที่เฉพาะเจาะจง การแสดงออกของยีนบางตัวคือ รัฐธรรมนูญ หมายความว่าพวกเขาแสดงในอัตราคงที่พอสมควรและไม่ทราบว่าอยู่ภายใต้กฎระเบียบ สิ่งเหล่านี้มักถูกเรียกว่า ยีนการดูแลทำความสะอาด เป็นผลมาจากการกลายพันธุ์ ผลิตภัณฑ์ยีนที่เหนี่ยวนำให้เกิดบางส่วนจะแสดงออกมาเป็นส่วนประกอบ การกลายพันธุ์ที่ส่งผลให้เกิดการแสดงออกของสิ่งที่เคยเป็นยีนควบคุมเรียกว่าa การกลายพันธุ์ที่เป็นส่วนประกอบ

21- pseudogene หมายถึงอะไร?

ส่วนที่ไม่ใช้งานของ DNA ที่เกิดจากการกลายพันธุ์ของยีนของผู้ปกครองที่ทำงานอยู่เรียกว่า ซูโดจีนีน และกล่าวอีกนัยหนึ่ง ซูโดจีนไม่เคยแสดงออกเพื่อสร้างอาร์เอ็นเอหรือโปรตีน

22- การถอดความแบบย้อนกลับคืออะไร?

เป็นการสังเคราะห์ DNA ที่ควบคุมโดย RNA เร่งปฏิกิริยาโดย reverse transcriptase

23- การประกบหมายถึงอะไร?

การแยก introns ออกจาก RNA พร้อมกับการรวม exons เรียกว่า Splicing

24. โมเลกุล chimeric หมายถึงอะไร?

โมเลกุล (เช่น DNA, RNA, โปรตีน) ที่มีลำดับที่ได้มาจากสปีชีส์ที่แตกต่างกันสองชนิด

25- ห้องสมุดคืออะไร?

ห้องสมุดคือชุดของชิ้นส่วนที่ถูกโคลนซึ่งเป็นตัวแทนของจีโนมทั้งหมด ห้องสมุดอาจเป็นจีโนม DNA (ซึ่งมีการแสดงทั้งอินตรอนและเอ็กซอน) หรือ cDNA (ซึ่งมีการแสดงเอ็กซอนเท่านั้น)

26- แทรกหมายถึงอะไร?

ความยาวเพิ่มเติมของคู่เบสใน DNA ซึ่งโดยทั่วไปแนะนำโดยเทคนิคของเทคโนโลยี recombinant DNA ถูกตั้งชื่อเป็น Insert

27- Sn RNA หมายถึงอะไร?

RNA นิวเคลียร์ขนาดเล็ก RNA ตระกูลนี้เป็นที่รู้จักกันดีที่สุดสำหรับบทบาทในการประมวลผล mRNA

28- Southern Blot คืออะไร?

เป็นวิธีการถ่ายโอน DNA จากเจลอากาโรสไปยังตัวกรองไนโตรเซลลูโลส ซึ่งโพรบที่เหมาะสมสามารถตรวจจับ DNA (เช่น DNA เสริมหรือ RNA)

29- Northern Blot คืออะไร?

เป็นวิธีการถ่ายโอน RNA จากเจลอากาโรสไปยังตัวกรองไนโตรเซลลูโลส ซึ่งโพรบที่เหมาะสมสามารถตรวจจับอาร์เอ็นเอได้

30- Western Blot คืออะไร?

มันเป็นวิธีการสำหรับถ่ายโอนโปรตีนไปยังตัวกรองไนโตรเซลลูโลส ซึ่งโปรตีนสามารถตรวจพบได้โดยโพรบที่เหมาะสม (เช่น แอนติบอดี)

31- เวกเตอร์คืออะไร?

พลาสมิด แบคเทอริโอฟาจ คอสมิด ไวรัสหรือโครโมโซมที่ DNA แปลกปลอมสามารถนำมาใช้สำหรับการโคลนนิ่งได้เรียกว่าพาหะของการโคลนนิ่ง

32- โอลิโกนิวคลีโอไทด์หมายถึงอะไร?

เป็นลำดับสั้น ๆ ที่กำหนดไว้ของนิวคลีโอไทด์ (ดีเอ็นเอหรืออาร์เอ็นเอแบบยืดสั้น) ที่เชื่อมต่อกันในการเชื่อมโยงฟอสโฟไดสเตอร์ทั่วไป

33- โคลนคืออะไร?

สิ่งมีชีวิต เซลล์ หรือโมเลกุลจำนวนมากที่เหมือนกันกับเซลล์หรือโมเลกุลของสิ่งมีชีวิตผู้ปกครองตัวเดียว

34- ตีคู่หมายถึงอะไร?

Tandem ใช้เพื่ออธิบายสำเนาหลายชุดของลำดับเดียวกัน (เช่น DNA) ซึ่งอยู่ติดกัน

35- spliceosome หมายถึงอะไร?

เป็นคอมเพล็กซ์โมเลกุลขนาดใหญ่ที่รับผิดชอบในการประกบ mRNA ของสารตั้งต้น spliceosome ประกอบด้วย RNA นิวเคลียร์ขนาดเล็กอย่างน้อยห้าตัว (snRNA U1, U2, U4, U5 และ U6) และโปรตีนหลายชนิด

36- อัตชีวประวัติคืออะไร?

การตรวจจับโมเลกุลกัมมันตภาพรังสี (เช่น DNA, RNA, โปรตีน) โดยการมองเห็นผลกระทบที่มีต่อฟิล์มถ่ายภาพเรียกว่า autoradiography

37- PCR คืออะไร?

เป็นวิธีการขยายดีเอ็นเอ นี่เป็นวิธีการที่ใช้เอนไซม์สำหรับการคัดลอกซ้ำ (และด้วยเหตุนี้การขยาย) ของ DNA สองสายที่ประกอบขึ้นเป็นลำดับยีนเฉพาะ

38- RT PCR คืออะไร?

เป็นวิธีการที่ใช้ในการหาปริมาณระดับ mRNA ที่อาศัยขั้นตอนแรกของการคัดลอก cDNA ของ mRNA ที่เร่งปฏิกิริยาโดย reverse transcriptase ก่อนการขยาย PCR และการหาปริมาณ

39- ความหมายโดย ถอดเสียง?

ทรานสคริปโทมคือคอลเล็กชันทั้งหมดของ mRNA ที่แสดงออกมาในสิ่งมีชีวิต


PCR ทำงานอย่างไร?

PCR เลียนแบบสิ่งที่เกิดขึ้นในเซลล์เมื่อมีการคัดลอกดีเอ็นเอ (จำลองแบบ) ก่อนการแบ่งเซลล์ แต่จะดำเนินการในสภาวะควบคุมในห้องปฏิบัติการ เครื่องที่ใช้เรียกง่ายๆ ว่าเครื่อง PCR หรือเครื่องเทอร์โมไซเลอร์ ใส่หลอดทดลองที่มีส่วนผสมของดีเอ็นเอที่น่าสนใจลงในเครื่อง และเครื่องจะเปลี่ยนอุณหภูมิให้เหมาะสมกับแต่ละขั้นตอนของกระบวนการ

ส่วนผสมมาตรฐานในส่วนผสมคือ:

  • ส่วนดีเอ็นเอที่น่าสนใจ
  • ไพรเมอร์เฉพาะ
  • เอนไซม์ DNA polymerase ทนความร้อน
  • DNA nucleotides สี่ประเภทที่แตกต่างกัน
  • เกลือที่จำเป็นในการสร้างสภาพแวดล้อมที่เหมาะสมสำหรับการทำงานของเอนไซม์

การทดสอบโมเลกุล SARS-CoV-2: จาก PCR สู่ LAMP ด้วย CRISPR

การยุติการระบาดใหญ่ของ SARS-CoV-2 / COVID-19 นั้น กำหนดให้เราต้องตรวจวินิจฉัยที่เข้มงวด ยาต้านไวรัสที่มีประสิทธิภาพ และวัคซีน แนวหน้ากำลังทดสอบ ดังที่ทราบในโพสต์ที่แล้ว [1] การทดสอบวินิจฉัยระดับโมเลกุลเป็นวิธีที่ดีที่สุดในการระบุการติดเชื้อ COVID-19 ที่ใช้งานอยู่ และจำนวนการทดสอบที่มีอยู่ได้เพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็ว การทดสอบสามารถทำได้โดยห้องปฏิบัติการเพื่อใช้เอง หรือโดยบริษัทเพื่อใช้ในห้องปฏิบัติการหลายแห่ง

เมื่อบริษัททำการทดสอบเพื่อจำหน่าย ความสามารถในการจำหน่ายและขายการทดสอบจะถูกควบคุมโดยสำนักงานคณะกรรมการอาหารและยาแห่งสหรัฐอเมริกา (US FDA) ในภาวะวิกฤต เช่นเดียวกับที่เรากำลังประสบอยู่ FDA ให้แนวทางที่รวดเร็วในการอนุมัติการทดสอบในระยะเวลาที่จำกัด กระบวนการอนุมัตินี้คือ Emergency Use Authorization (EUA) ช่วยลดภาระในการตรวจสอบ ระหว่างกลางเดือนมีนาคมถึงต้นเดือนพฤษภาคม อนุมัติ EUA สำหรับการวินิจฉัยระดับโมเลกุล 55 รายการ โดยจะได้รับมากกว่าทุกวัน การทดสอบบางอย่างใช้งานได้ดีและการทดสอบอื่นๆ ก็ทำได้ไม่ดี [2] การทดสอบใช้วิธีการที่หลากหลาย แต่จะทำงานอย่างไร

เพื่อตอบคำถามเกี่ยวกับวิธีการทำงาน เราได้พัฒนาประวัติโดยย่อของอินโฟกราฟิกการวินิจฉัยระดับโมเลกุล (การทดสอบ) (ขวา) และบล็อกที่ยาวกว่าปกติเพื่ออธิบายแผงข้อมูล (ด้านล่าง)

PCR - ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสให้รากฐาน

การทดสอบระดับโมเลกุลเกือบทั้งหมดต้องการขั้นตอนการขยายดีเอ็นเอ โดยทั่วไปจะทำผ่าน PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR เป็นตัวเปลี่ยนเกมในอณูชีววิทยา [3] เพราะช่วยให้เราสามารถระบุโมเลกุลดีเอ็นเอที่มีความเข้มข้นต่ำเกินไปที่จะตรวจพบได้ด้วยวิธีการทั่วไป PCR เพิ่มความเข้มข้นของ DNA โดยการคัดลอกโมเลกุล DNA หลายล้านตัวตามลำดับเฉพาะเพื่อให้มองเห็นสิ่งที่มองไม่เห็น

PCR เกิดขึ้นได้จากแนวคิดทางพันธุกรรมพื้นฐานสองประการ ความก้าวหน้าทางเทคโนโลยีสองประการ และคณิตศาสตร์บางส่วน

แนวคิดทางพันธุกรรมที่หนึ่ง: เบสที่ประกอบเป็น DNA และ RNA (กรดนิวคลีอิก) ได้รับคำสั่งจาก 5' ถึง 3' และก่อตัวเป็นเกลียวคู่ที่ต้านกันในคฤหาสน์เฉพาะของลำดับผ่านพันธะไฮโดรเจน A (adenine) จับคู่กับ T (thymine) และ C (cytosine) จับคู่กับ G (guanine) ใน RNA U (uracil) จะแทนที่ T. Complementary base จับคู่กันผ่านพันธะไฮโดรเจนที่อ่อนแอ แต่ให้ความร่วมมือ ความแรงของปฏิสัมพันธ์นั้นแปรผันตามจำนวนพันธะไฮโดรเจน เมื่อจับคู่ A และ T จะสร้างพันธะไฮโดรเจนสองพันธะ และ C และ G ก่อตัวเป็นสาม ดังนั้นคู่เบส CG จึงแข็งแกร่งกว่าคู่เบสของ AT (หรือ AU) เมื่อมีเบสเข้ามาเกี่ยวข้องในการจับคู่โดยใช้เกลียวที่ยาวขึ้น เกลียวก็จะยึดติดกันแน่นขึ้น การก่อตัวของคู่เบสเรียกว่าไฮบริไดเซชันหรือการหลอม

เนื่องจากพันธะไฮโดรเจนเป็นพันธะที่อ่อนแอ การจับคู่เบสอาจถูกรบกวนด้วยความร้อนและปัจจัยอื่นๆ นั่นคือ ที่อุณหภูมิหนึ่ง โมเลกุลดีเอ็นเอสายคู่ (dsDNA) สามารถ "ละลาย" เป็นโมเลกุลสายเดี่ยว (ssDNA) ที่แยกจากกัน อุณหภูมิหลอมเหลว (TNS) เป็นฟังก์ชันของตัวเลขและชนิดของคู่เบส (AT, AU หรือ GC) NSNS กำหนดสถานะที่ครึ่งหนึ่งของโมเลกุลถูกไฮบริดและครึ่งหนึ่งไม่ได้ ในระดับโมเลกุล สถานะ dsDNA และ ssDNA มีการแลกเปลี่ยนกันอย่างรวดเร็ว เช่น การหายใจ นอกจากความร้อน สารเคมี โปรตีน และการแข่งขันจากโมเลกุล ssDNA อื่นๆ ยังสามารถขัดขวางการจับคู่เบสได้ ดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอ โมเลกุลยังสามารถก่อรูปสายคู่ภายในโมเลกุลโดยที่บริเวณเฉพาะที่ในลำดับพับเข้าด้วยกันเพื่อสร้างโครงสร้างแบบวนรอบต้นกำเนิด

ดังนั้น แนวคิดแรกของ PCR คือกรดนิวคลีอิก "ค้นหา" กรดนิวคลีอิกอื่นๆ และก่อตัวเป็นลูกผสมในสารละลายแม้ว่าจะจับคู่เบสเสริม (hybridization) การผสมพันธุ์อาศัยพันธะไฮโดรเจนที่อ่อนแอ การขึ้นรูปและการหลอมของบริเวณเกลียวคู่นั้นเป็นไดนามิกและถูกควบคุมโดยอุณหภูมิและปัจจัยอื่นๆ

แนวคิดทางพันธุกรรมที่สอง: ดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอสามารถคัดลอกในรูปแบบที่กำกับโดยเอนไซม์ที่เรียกว่าพอลิเมอเรส โพลีเมอเรสเพิ่มเบสให้กับสายกรดนิวคลีอิกผ่านปฏิกิริยาที่รวมนิวคลีโอไซด์ไตรฟอสเฟตใหม่กับ 3'-OH (กลุ่มไฮดรอกซิล) อิสระบนสาย DNA หรือ RNA ที่มีอยู่ กฎการจับคู่เบส และลำดับของแม่แบบกรดนิวคลีอิก กำหนดว่าจะเพิ่มนิวคลีโอไซด์ไตรฟอสเฟตใด T's (U's) ถูกเพิ่มข้ามจาก A, C ถูกเพิ่มข้ามจาก G และในทางกลับกัน กล่าวโดยย่อ โพลีเมอเรสอ่านเทมเพลตเพื่อเขียนลำดับที่ประกอบกับเทมเพลตนั้น

ความก้าวหน้าทางเทคนิคที่หนึ่ง: การค้นพบ Taq polymerase [4] สั้นๆ แทค (เทอร์มัส อควาติคัส) เป็นแบคทีเรียที่เติบโตในบ่อน้ำพุร้อนในอุทยานแห่งชาติเยลโลว์สโตน เนื่องจากมันเติบโตที่อุณหภูมิสูง เอ็นไซม์ของมันจึงสามารถทนต่อความร้อนได้สูง ใกล้เดือด ที่อุณหภูมิดังกล่าว โมเลกุล DNA แบบลูกผสม ไม่ว่าจะมีความยาวเท่าใดก็ได้ มักจะหลอมรวมเป็นโมเลกุลสายเดี่ยว เว้นแต่จะได้รับการคุ้มครองโดยโปรตีน

ความก้าวหน้าทางเทคนิคที่สอง: ความสามารถในการสังเคราะห์ DNA ทางเคมีด้วยวิธีอัตโนมัติ [5] จากด้านบน โพลีเมอเรส "อ่าน" เทมเพลตเพื่อเพิ่มฐานเสริมให้กับกลุ่ม 3'-OH กล่าวอีกนัยหนึ่งต้องเตรียมปฏิกิริยาการเติมเบส นี่คือสาเหตุที่ DNA สังเคราะห์บางตัวเรียกว่าไพรเมอร์ ชิ้นส่วนของ DNA ผสมพันธุ์กับแม่แบบ DNA และพอลิเมอเรสก่อให้เกิดความซับซ้อนที่สามารถอ่านแม่แบบและเพิ่มฐานได้ การสังเคราะห์ดีเอ็นเอทางเคมีแบบอัตโนมัติทำให้สามารถสร้างโมเลกุลดีเอ็นเอใหม่จากลำดับดีเอ็นเอตามขนาดได้ ดังนั้น DNA ใดๆ สามารถคัดลอกมาจากสภาพแวดล้อมใดก็ได้หากเราทราบลำดับของมัน

คณิตศาสตร์บางส่วน: ใน PCR นั้น CR ย่อมาจากปฏิกิริยาลูกโซ่ ปฏิกิริยาลูกโซ่สามารถเกิดขึ้นได้เนื่องจากแต่ละสายของ DNA สามารถคัดลอกไปเป็นสายคู่สม เพิ่มจำนวนโมเลกุลดีเอ็นเอเป็นสองเท่าด้วยการให้ความร้อนแต่ละรอบ (หลอมเหลว) ไพรเมอร์ (ไฮบริไดซ์) และคัดลอก (โพลีเมอร์ไรซิ่ง) การเพิ่มขึ้นทางเรขาคณิต (2 n ) ส่งผลให้ DNA เพิ่มขึ้นประมาณ 1,000 เท่า มากกว่าจำนวนเดิม หลังจาก 10 รอบ เพิ่มขึ้นหนึ่งล้านเท่าหลังจาก 20 รอบ และเพิ่มขึ้นอีกพันล้านเท่าหลังจาก 30 รอบ แต่ละรอบของการทำความร้อน ความเย็น และการปรับอื่นๆ ใช้เวลาประมาณ 5 นาที เราจะกลับมาที่นี่ในภายหลัง

RT-PCR - Reverse Transcriptase PCR ตรวจจับ RNA โดยแปลงเป็น DNA

PCR นั้นยอดเยี่ยมสำหรับการระบุโมเลกุล DNA ที่เฉพาะเจาะจง แล้วอาร์เอ็นเอล่ะ? ไวรัสหลายชนิด รวมทั้ง SARS-CoV-2 ใช้ RNA เป็นสารพันธุกรรม โดยธรรมชาติแล้ว DNA จะถูกคัดลอก (คัดลอก) ไปเป็น RNA เมื่อมีการแสดงออกของยีน RNA ยังสามารถคัดลอกไปยัง DNA ผ่านการถอดรหัสแบบย้อนกลับ เอนไซม์ reverse transcriptase ที่พบใน retroviruses [6] (ไวรัส RNA ชนิดอื่น) ทำให้สามารถคัดลอก RNA ลงใน DNA ในห้องปฏิบัติการได้ เราแค่ต้องการไพรเมอร์ปฏิกิริยากับไพรเมอร์ดีเอ็นเอ RT-PCR (reverse transcriptase PCR) จึงมีสองขั้นตอน: 1. แปลง RNA เป็น DNA 2. ใช้ PCR เพื่อขยาย DNA ที่ต้องการ เป็นไปได้ที่จะรวมขั้นตอนเหล่านี้ไว้ในหลอดปฏิกิริยาเดี่ยว

RT-PCR - PCR แบบเรียลไทม์ วัดค่าเบื้องต้น [DNA] โดยการขยายและการตรวจจับข้อต่อ

PCR และ RT-PCR ทำให้สามารถตรวจหา DNA หรือ RNA ในปริมาณเล็กน้อยในตัวอย่างจากเส้นผม เศษกระดูก ก้านสำลีจากจมูกและลำคอ หยดเลือด ปัสสาวะ อุจจาระ พื้นผิว และแหล่งอื่นๆ ในบางแอปพลิเคชัน เราจำเป็นต้องรู้ว่ามีการตรวจพบ DNA หรือ RNA มากน้อยเพียงใด ตัวอย่างเช่น เพื่อดูว่าจำนวน virion เพิ่มขึ้นหรือไม่ ในกรณีเหล่านี้ PCR ต้องเป็นเชิงปริมาณ หากเราสามารถจับคู่ความสามารถในการวัดจำนวนความเข้มข้นของ DNA (บันทึกเป็น [DNA]) การวัดกับจำนวนรอบ PCR ในแบบเรียลไทม์ เราก็สามารถใช้การเติบโตสัมพัทธ์ของความเข้มของสัญญาณเพื่ออนุมานจำนวนโมเลกุลดีเอ็นเอเริ่มต้นที่ กำลังคัดลอก หลักการพื้นฐานของ RT-PCR (ยังแสดงเป็น qPCR ดังนั้นเราจึงไม่สับสนกับ RT-PCR ข้างต้น) คือต้องใช้รอบ PCR น้อยลงในการขยายโมเลกุลจำนวนมากขึ้นและได้จำนวนที่แน่นอน ตัวอย่างที่มีโมเลกุลมากเป็นสองเท่าของอีกตัวอย่างหนึ่งคือหนึ่งวัฏจักรเต็มไปข้างหน้าในการเพิ่มโมเลกุลเป็นสองเท่า แนวโน้มนี้สามารถสังเกตได้โดยการพล็อตความเข้มของสัญญาณเทียบกับหมายเลขรอบสำหรับแต่ละตัวอย่าง

ในเชิงปริมาณ จะต้องเปรียบเทียบสัญญาณระหว่างตัวอย่างระหว่างล็อกเฟสของการเติบโตของ [DNA] และนำไปเปรียบเทียบกับตัวอย่างกลุ่มควบคุมที่มี [DNA] ที่รู้จักด้วย แม้ว่าจำนวน DNA จะเพิ่มขึ้นเป็นสองเท่าในแต่ละรอบ แต่ก็ไม่ได้เป็นเช่นนั้นตลอดไป การเปลี่ยนสภาพของเอนไซม์ การสะสมผลพลอยได้จากปฏิกิริยา และปัญหาอื่นๆ ได้จำกัดจำนวนรอบที่ [DNA] ใช้ได้จริง ขีดสูงสุดนี้สร้างเส้นโค้ง S ที่สังเกตได้เมื่อมีการวางแผนสัญญาณเป็นฟังก์ชันของหมายเลขรอบ

แล้วเราจะสร้างสัญญาณเหล่านั้นได้อย่างไร?

สีย้อมประสาน: มีหลายวิธีในการวัดความเข้มข้นของ DNA วิธีหนึ่งคือการใช้สีย้อมเรืองแสง เช่น สีเขียว SYBR ซึ่งจะเรืองแสงมากขึ้นเมื่อจับ DNA ที่มีเกลียวคู่ สีเขียว SYBR จับกับ DNA ผ่านการแทรกซ้อน ซึ่งเป็นกระบวนการที่โมเลกุลของสีย้อมเลื่อนไปมาระหว่างเบสของ DNA เมื่อสีย้อมประสานจับ DNA พวกมันจะเคลื่อนเข้าสู่สภาพแวดล้อมที่ไม่ชอบน้ำซึ่งจะเอาน้ำออกซึ่งอาจดับสัญญาณเรืองแสงของพวกมัน การแทรกสอดจะเพิ่มความเข้มของสัญญาณของสีย้อม (1,000 เท่าสำหรับสีเขียว SYBR) ดังนั้น เมื่อ [dsDNA] เพิ่มขึ้น ค่าการเรืองแสงของตัวอย่างก็เพิ่มขึ้นเช่นกัน

โพรบ: ปัญหาเกี่ยวกับสีย้อมประสานคือไม่จำเพาะเจาะจง พวกมันผูกกับ dsDNA ใดๆ โปรดจำไว้ว่ากฎข้อเดียวสำหรับโพลีเมอเรสคือเทมเพลตและ 3'-OH ฟรี เบสเพียงไม่กี่ชนิดสามารถใช้เป็นไพรเมอร์ได้ ดังนั้น PCR สามารถมีสิ่งประดิษฐ์จากการพับดีเอ็นเอในตัวมันเองไปจนถึงการหลอมด้วยตนเองของไพรเมอร์ (ไพรเมอร์ไดเมอร์) หรือการผสมแบบไฮบริดกับลำดับอื่นๆ เมื่อคัดลอกแล้ว สิ่งประดิษฐ์สามารถคัดลอกได้มากขึ้น และเพิ่มสัญญาณรบกวนของการทดสอบ หากเรามีวิธีการแยกแยะระหว่างสิ่งประดิษฐ์จากการทดสอบการขยายดีเอ็นเอแบบจำเพาะและแบบไม่จำเพาะจะลดลง โพรบ DNAs สังเคราะห์ที่ออกแบบมาเพื่อผสมพันธุ์กับลำดับเฉพาะภายในเป้าหมายที่ต้องการ (ตำแหน่งภายในถึงไพรเมอร์) เป็นวิธีจำกัดการวัดที่โมเลกุลที่เราต้องการวัด

ตัวอย่างของโพรบที่ใช้กันทั่วไปสองตัวอย่างคือ โพรบ TaqMan และ บีคอนโมเลกุล. ใช่ TaqMan ตั้งชื่อตาม PacMan ส่วนหนึ่งเพราะเราชอบวาดเอนไซม์อย่าง PacMan Taq ยังคล้องจองกับ Pac และเนื่องจาก DNA polymerase ยังกิน DNA (5'-exonuclease) ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของการแก้ไขข้อผิดพลาด TaqMan กลายเป็นสิ่งที่เหมาะสม ทั้ง TaqMan และโมเลกุลบีคอนมีคุณสมบัติที่ค่าการเรืองแสงเพิ่มขึ้นตามหน้าที่ของ [DNA] แต่วิธีสร้างการเรืองแสงในการทดสอบเหล่านี้ขึ้นอยู่กับกลไกสองอย่างที่แตกต่างกันมาก

ในการตรวจวัดทั้งสองวิธี การดับการเรืองแสงถูกใช้เพื่อระงับสัญญาณของโพรบที่ไม่ผูกมัด ดังที่กล่าวไว้ข้างต้น การชุบแข็งอาจไม่จำเพาะเจาะจง เช่น การให้น้ำดับการเรืองแสงของสีย้อมแบบสอดประสาน การดับยังสามารถเกิดขึ้นได้จากปฏิกิริยาของโมเลกุลจำเพาะซึ่งโมเลกุลของตัวดับจะดูดซับแสงที่ปล่อยออกมาจากโมเลกุลเรืองแสง (ฟลูออเรสเซนต์) ในกรณีหลังนี้ ฟลูออร์และสารดับต้องอยู่ใกล้กัน

โพรบ TaqMan อาศัยกิจกรรม 5'-exonuclease ของ DNA polymerase ฟลูออร์และตัวดับจะติดอยู่กับโพรบ หากโพรบถูกผูกมัดกับเป้าหมายดีเอ็นเอหรือปราศจากสารละลาย ฟลูออร์จะถูกดับ เมื่อจุดยืนของ DNA เป้าหมายละลายในระหว่างเฟสความร้อน PCR หัววัด TaqMan จะผสมพันธุ์กับลำดับเป้าหมายภายใน เมื่อ DNA polymerase คัดลอก DNA ใหม่ มันจะย่อยโพรบที่ถูกผูกไว้ (ผ่าน 5'-exonuclease) และปล่อยฟลูออร์ ทำให้เกิดสัญญาณ ปริมาณของฟลูออร์ที่ปล่อยออกมา (สัญญาณ) สอดคล้องกับ [DNA]

โมเลกุลบีคอนทำงานตรงกันข้าม พวกมันถูกสร้างขึ้นเพื่อให้ DNA สังเคราะห์สร้างโครงสร้างแบบวนรอบลำต้นด้วยลำดับดีเอ็นเอของโพรบที่อยู่ในลูป ในสภาพที่ไม่ถูกผูกไว้ ก้านจะก่อตัวขึ้นเพื่อจับสารดับใกล้ฟลูออร์ เมื่อโพรบผสมพันธุ์กับเป้าหมายของ DNA ก้านจะละลาย เนื่องจากจำนวนของฐานโพรบมากกว่าจำนวนฐานของสเต็ม มันจึงสร้างปฏิสัมพันธ์ที่แข็งแกร่งขึ้น สัญญาณจะเกิดขึ้นเมื่อฟลูออร์และตัวดับห่างกันมากพอ ในขณะที่โพรบจะถูกแทนที่เมื่อคัดลอก DNA โพรบจะถูกผสมพันธุ์นานพอที่จะวัดสัญญาณได้

Digital PCR - เพิ่มความแม่นยำด้วยการทำปฏิกิริยาส่วนบุคคล

แต่ละรอบของ PCR เชิงปริมาณจะวัดการเปลี่ยนแปลงสองเท่าของความเข้มข้นของ DNA มีตัวอย่างมากมายในการวิเคราะห์ทางพันธุกรรมและการแสดงออกของยีน ซึ่งเราต้องการนับจำนวนโมเลกุลของกรดนิวคลีอิกเริ่มต้นด้วยความแม่นยำมากขึ้น เนื่องจากเราไม่สามารถนับแค่โมเลกุลได้ เราจึงต้องการวิธีอนุมานค่าเริ่มต้น โดยทั่วไปจะทำได้โดยการเตรียมการเจือจางแบบจำกัด

การจำกัดการเจือจางเป็นกระบวนการที่ตัวอย่างถูกเจือจางจนถึงจุดที่ภาชนะน่าจะมีโมเลกุลเดี่ยว ตัวอย่างเช่น หากฉันมีโมเลกุลสามตัว และภาชนะของฉันบรรจุหนึ่งไมโครลิตร จากนั้นการเจือจางตัวอย่างเก้าเท่าจะให้โมเลกุลสามตัวแก่ฉันในเก้าไมโครลิตร ถ้าแบ่งเป็นเก้าตู้ หกจะมีศูนย์โมเลกุล และสามจะมีหนึ่งโมเลกุล บางครั้งภาชนะจะมีสองโมเลกุล เมื่อแต่ละคอนเทนเนอร์มีหนึ่งโมเลกุล เราสามารถเรียกใช้ PCR ได้มากเท่าที่จำเป็นเพื่อรับสัญญาณที่ดี และเพียงแค่นับแชมเบอร์ที่เป็นบวกและลบเพื่อให้ได้เอาต์พุตไบนารี 1 หรือ 0 (ดิจิทัล)

ด้วยการถือกำเนิดของไมโครฟลูอิดิกส์และวิธีการปล่อยน้ำมัน เราสามารถสร้างภาชนะจากหยดน้ำเล็กๆ น้อยๆ ได้ แต่ละหยดประกอบด้วยโมเลกุลของ DNA หรือไม่มีเลยเนื่องจากการเจือจางที่จำกัด ปฏิกิริยา PCR จะทำงานเป็นรอบจำนวนหนึ่งโดยใช้ TaqMan หรือโพรบบีคอนระดับโมเลกุล เมื่อปฏิกิริยาเสร็จสิ้น ไหลหยด ไฟล์เดียว ผ่านเส้นเลือดฝอยที่ติดอยู่กับแหล่งกำเนิดแสงและเครื่องตรวจจับเพื่อวัดสัญญาณ จำนวนหยดบวกจะถูกนับและเปรียบเทียบระหว่างกลุ่มตัวอย่าง

Digital PCR ยังให้คำย่อใหม่แก่เราอีกด้วย ในกรณีนี้ dPCR ย่อมาจาก Digital PCR และ ddPCR ย่อมาจาก Digital droplet PCR ทั้ง dPCR และ ddPCR มีความหมายในสิ่งเดียวกัน แต่เนื่องจาก PCR เป็นธุรกิจขนาดใหญ่ คำจึงใช้แทนกันได้สำหรับการสร้างแบรนด์

ไอโซเทอร์มอล PCR - แสงใต้หลอดไฟ

PCR ต้องการวงจรความร้อน ความเย็น และการปรับอื่นๆ แต่ละรอบใช้เวลาประมาณห้านาทีกับอุปกรณ์มาตรฐาน และกระบวนการทดสอบทั้งหมด (จากตัวอย่างไปยังผลลัพธ์) อาจใช้เวลาสี่ชั่วโมงหรือมากกว่านั้น รอบเวลาสามารถสั้นลงได้โดยใช้อุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกเฉพาะซึ่งใช้ "ท่อ" เล็กๆ ในปฏิกิริยาการไหลผ่านการไล่ระดับอุณหภูมิ หากวัฏจักร PCR สามารถทำงานที่อุณหภูมิคงที่ซึ่งปรับ "ไดนามิก" ของการผสมข้ามพันธุ์ การหลอมเหลว และการทำงานของเอนไซม์ให้เหมาะสม การขยายดีเอ็นเอสามารถดำเนินไปอย่างรวดเร็วโดยความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นเร็วกว่าอัตราการเพิ่มเป็นสองเท่าของ PCR อย่างมีนัยสำคัญ เนื่องจากจะไม่มีการ "หยุด" กระบวนการนี้เรียกว่าการขยายไอโซเทอร์มอล ไม่ใช่ PCR อีกต่อไป เนื่องจากไม่มีปฏิกิริยาลูกโซ่ เป็นเพียงการขยายขนาดมหาศาล การทดสอบ 13 นาทีที่พัฒนาโดย Abbot Laboratories ที่ใช้ในทำเนียบขาวคือการทดสอบการขยายไอโซเทอร์มอลด้วยโพรบบีคอนระดับโมเลกุล [2]

การขยายสัญญาณไอโซเทอร์มอลมีหลายประเภท ตัวอย่างเช่น Loop-mediated AMPlification (LAMP) กำลังได้รับความนิยมเพิ่มขึ้น การทดสอบ LAMP ต้องใช้ไพรเมอร์สี่ตัวและไซต์เป้าหมายหกแห่ง (ดูอินโฟกราฟิก) ไพรเมอร์สองตัว (F2, R2c) มีอะแด็ปเตอร์ (บริเวณของลำดับบนไพรเมอร์ที่ปรับปรุงกระบวนการต่างๆ) ที่มีลำดับ (F1c, R1) ที่ประกอบกับตำแหน่ง (F1c, R1) ภายในเป้าหมายของ DNA ในระยะหลังของปฏิกิริยา อะแด็ปเตอร์เหล่านี้ผสมพันธุ์กับไซต์เหล่านั้นเพื่อสร้างโครงสร้างแบบวนซ้ำภายในเป้าหมาย ไพรเมอร์อื่นๆ อีกสองชนิด (F3, R3c) ที่เสริมไปยังจุดสิ้นสุด (F3c, R3) ของเป้าหมายถูกใช้เพื่อขยายเป้าหมายเดิม เช่น PCR

เมื่อรีเอเจนต์ ไพรเมอร์ นิวคลีโอไทด์ เอ็นไซม์ (ที่มีคุณสมบัติการเคลื่อนตัวของเกลียว) และส่วนประกอบอื่นๆ ผสมกับ DNA ตัวอย่างและตั้งอุณหภูมิของปฏิกิริยาไว้ การสังเคราะห์ DNA ทุกชนิดจะเกิดขึ้นพร้อมกันและทำงานในกระบวนการต่อเนื่อง เราวาดภาพในสามขั้นตอนเพื่อให้เราสามารถเข้าใจได้ แต่ก็ยังสับสนอยู่ ฉันชอบดูวิดีโอนี้ [11]

ในขั้นตอนแรก ไพรเมอร์ F2 และ R2c จะผสมพันธุ์กับไซต์เป้าหมายระดับกลาง (F2c, R2) การเกิดพอลิเมอไรเซชันที่เป็นผลลัพธ์จะผลิตโมเลกุลดีเอ็นเอที่มีปลาย (F1c, R1) ที่สามารถสร้างโครงสร้างวงรอบต้นกำเนิดด้วยไซต์ F1 และ R1c ที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่ ถัดไป ไพรเมอร์ F3 และ R3c จะผสมพันธุ์กับไซต์สุดท้าย (F3c, R3) และเตรียมการสังเคราะห์สายเป้าหมายเดิม ซึ่งขณะนี้พร้อมใช้งานสำหรับขั้นตอนที่หนึ่ง ในขั้นตอนที่สาม บริเวณต้นกำเนิด-ลูปจะเพิ่มส่วนปลาย 3'-OH เพิ่มเติมซึ่งใช้เพื่อเริ่มต้นการสังเคราะห์ดีเอ็นเอมากขึ้น ไพรเมอร์อื่นๆ ยังสามารถหลอมเพื่อทำซ้ำวงจรการสังเคราะห์ การวนซ้ำ และการสังเคราะห์ ภายในไม่กี่นาที มีการคัดลอกดีเอ็นเอเพียงพอเพื่อให้ตรวจพบได้ง่าย การตรวจจับสามารถทำได้เช่นเดียวกับใน qPCR โดยการเรืองแสงหรือโดยการสอบวิเคราะห์สี (ไม่ได้กล่าวถึง)

ข้อดีของ LAMP คือระยะเวลาในการทดสอบสั้น อีกวิธีหนึ่งคือสามารถใช้วิธีการนี้นอกห้องปฏิบัติการในรูปแบบที่เรียกว่าจุดดูแล (POC) หรือจุดที่ต้องการ (PON)

A CRISPR PCR

การทดสอบระดับโมเลกุลมีการพัฒนาและปรับปรุงอย่างต่อเนื่อง เอนไซม์ CRISPR เป็นส่วนเสริมล่าสุดของชุดเครื่องมือทดสอบโมเลกุล [12] ระบบ CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) เป็นรูปแบบหนึ่งของระบบภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวที่ใช้โดยแบคทีเรียที่รวมหน่วยกรดนิวคลีอิก CRISPR เข้ากับเอนไซม์ตัด DNA (หรือ RNA) (Cas) เมื่อสารเชิงซ้อน CRISPR/Cas จับกับกรดนิวคลีอิกของฟาจ (ไวรัสแบคทีเรีย) แปลกปลอม ผ่านการไฮบริไดเซชัน เอ็นไซม์ Cas จะตัดกรดนิวคลีอิกของผู้บุกรุก [13] ในการวินิจฉัยระดับโมเลกุล ระบบ CRISPR ถูกควบคุมเพื่อเพิ่มความจำเพาะในการทดสอบและสร้างสัญญาณเรืองแสงเมื่อตรวจพบลำดับ DNA หรือ RNA ที่เฉพาะเจาะจง

การทดสอบ COVID-19 ในปัจจุบัน - เชอร์ล็อค (ปลดล็อกนักข่าวด้วยเอนไซม์ความไวสูงเฉพาะ [12]) การทดสอบ CRISPR SARS-CoV-2 - มีสองขั้นตอน ขั้นตอนแรกรวม reverse transcriptase และ LAMP เพื่อขยาย DNA ไพรเมอร์ LAMP บางตัวรวมถึงอะแด็ปเตอร์ที่มีลำดับโปรโมเตอร์ T7 RNA โพลิเมอร์ที่ใช้ในขั้นตอนที่สอง ในขั้นตอนนั้น ลำดับเป้าหมาย RNA ถูกสร้างโดย T7 RNA polymerase เมื่อโมเลกุลอาร์เอ็นเอเหล่านี้ถูกสร้างขึ้น พวกมันสามารถจับกับเอ็นไซม์ Cas13 (หนึ่งในนิวคลีเอส CRISPR [14] จำนวนมาก [14]) ซึ่งรวมถึงโพรบที่มีลำดับคล้าย CRISPR ที่มีบริเวณประกอบกับลำดับเป้าหมาย เมื่อโพรบจับกับเป้าหมาย เอ็นไซม์ Cas13 จะตัดและปล่อยเป้าหมาย การตัดนี้กระตุ้นกิจกรรมของนิวคลีเอสที่ไม่เฉพาะเจาะจงเพิ่มเติม (การตัด DNA) ซึ่งแยกโมเลกุลดีเอ็นเอสังเคราะห์ที่เหมือน TaqMan ปล่อยฟลูออร์ออกจากตัวดับและสร้างสัญญาณ (ขั้นตอนการปลดล็อคนักข่าวด้วยเอนไซม์ของเชอร์ล็อค) ในการทดสอบ CRISPR สัญญาณเป็นแบบทั่วไป แต่เป็นผลมาจากปฏิสัมพันธ์ของโมเลกุลที่ขึ้นกับลำดับที่จำเพาะสูง

55 EUA ของ FDA แสดงความหลากหลายสูงในการทดสอบระดับโมเลกุลของ SARS-CoV-2/COVID-19

การตรวจวินิจฉัยระดับโมเลกุลของเชื้อโควิด-19 ในปัจจุบันมีความหลากหลายและไม่มีข้อโต้แย้ง [1] แต่ละวิธีข้างต้นถูกใช้ไม่ทางใดก็ทางหนึ่งในการทดสอบอย่างน้อยหนึ่งครั้ง มิฉะนั้น ฉันจะไม่ใช้เวลามากในการครอบคลุมรูปแบบการทดสอบที่แตกต่างกัน อันที่จริง เราสามารถเรียนรู้ได้มากมายจากคำแนะนำในการใช้งานของ EUA (IFU) หรือไฟล์ PDF สรุปของ EUA ที่โพสต์โดย FDA [15] แต่ละไฟล์มีข้อมูลเกี่ยวกับรูปแบบการทดสอบ วิธีเรียกใช้การทดสอบ และข้อมูลอื่นๆ (ขีดจำกัดประสิทธิภาพการตรวจจับพร้อมตัวควบคุม) โดยมีข้อแม้ว่ามีวิธีการเปิดเผยที่ดีและคำอธิบายกล่องดำผสมกันที่ผู้ผลิตไม่ต้องการเปิดเผย เทคนิคที่เป็นกรรมสิทธิ์ รูปแบบคำอธิบายทั้งหมดแตกต่างกันและรายงานข้อมูลที่สำคัญได้หลายวิธี ดังนั้นจึงเป็นเรื่องยากที่จะวิเคราะห์รายงานอย่างเป็นระบบ แต่เราสามารถเรียนรู้บางสิ่งจากคำสำคัญได้

ฉันใช้สองวิธีในการวิเคราะห์คำหลักใน EUA อย่างแรกคือการดูเงื่อนไข "PCR" พบ PCR, RT-PCR, RT-qPCR, RTqPCR, ddPCR, RT-ddPCR, rRT-PCR, dPCR, RT-dPCR, QPCR, micPCR และ RealPCR ในเอกสารอย่างน้อยหนึ่งฉบับ เอกสาร EUA สองสามฉบับไม่มีคำศัพท์ PCR เนื่องจากใช้วิธีการเก็บอุณหภูมิเพื่อขยาย DNA เป้าหมาย การทดสอบทั้งหมดใช้ reverse transcriptase ไม่ว่าพวกเขาจะพูดหรือไม่ก็ตาม ในการค้นหาคำศัพท์ PCR และนับจำนวนการทดสอบที่ใช้คำศัพท์นั้น ฉันได้เขียนสคริปต์ Python ที่ใช้ไลบรารี Natural Language Tool Kit (NLTK) และไลบรารี Python pdf เพื่อแยกคำที่ไม่ซ้ำทั้งหมดออกจากเอกสารแต่ละฉบับ ฉันรันสคริปต์นี้ในไดเร็กทอรีของไฟล์ (EUA IFU/ข้อมูลสรุปทั้งหมด) และไพพ์เอาต์พุตไปที่ grep "PCR" และสร้างรายการเงื่อนไข PCR ทั้งหมด คำศัพท์แต่ละคำที่แสดงรายการตามแต่ละเอกสาร จะถูกนับเพื่อแสดงรายการคำศัพท์และจำนวนเอกสารที่ปรากฏในโดยใช้สคริปต์ "การนับจำนวนคำ" อย่างง่าย รายการนี้ได้รับการแก้ไขด้วยตนเองเพื่อลบคำว่า "ส่วนย่อย" ต่างๆ ที่เกิดจากเครื่องหมายยัติภังค์ในชื่อ ขั้นตอนสุดท้ายคือการสร้าง word cloud [16] สำหรับอินโฟกราฟิก

เงื่อนไข PCR เพียงอย่างเดียวให้รายละเอียดเล็กน้อย หากต้องการเรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับเทคโนโลยีเฉพาะที่ใช้ การค้นหาคำได้ดำเนินการใน DEVONThink [17] อันดับแรก ฉันใช้คำศัพท์ TaqMan, beacon, CRISPR, isothermal, digital และ TaqPath อย่างอิสระเพื่อระบุจำนวนของ EUA ที่มีคำเฉพาะนั้น เอกสารมากกว่าครึ่งหนึ่งใช้ข้อกำหนดอย่างน้อยหนึ่งข้อ ถัดไป ข้อความค้นหา "และไม่ใช่" (!TaqMan & !beacon & !CRISPR & !isothermal & !digital &!TaqPath) ได้รับการทดสอบแล้ว การอ่านเอกสารที่เหลืออีก 23 ฉบับระบุคำต่างๆ เช่น "exonuclease", "degrades" (เช่นเดียวกับในโพลีเมอเรสทำให้โพรบเสื่อมคุณภาพ) และ "เสื่อมโทรม" ซึ่งฉันได้รวมไว้ในการค้นหาและใช้ในการอนุมานรูปแบบการทดสอบ กำลังเพิ่ม !exonuclease & !degrades & ! ลดลงเป็นรายการของเงื่อนไข "& amp not" เหลือเอกสาร 12 ฉบับ ในเอกสารที่เหลือเหล่านี้ สามารถอนุมานได้อีกสองสามฉบับ แต่เอกสารห้าฉบับยังคงทึบเกินไปและถูกจัดประเภทว่าไม่ได้กำหนดไว้ ฉันพล็อตข้อมูลผลลัพธ์ในแผนภูมิวงกลมอินโฟกราฟิกเพื่อแสดงวิธีการที่หลากหลาย

นับตั้งแต่การค้นพบ PCR เมื่อเกือบ 40 ปีที่แล้ว เทคโนโลยีได้ก้าวหน้าไปในหลายๆ ด้าน RT-PCR is a predominant method in molecular diagnostic testing, and, as evidenced by the growing list of available SARS-CoV-2 tests, PCR concepts and components are continually refined and built upon as the industry searches for new, faster, more sensitive, more specific, and easier to run formats. Of course, technology alone does not win. As recently noted in the news, the tests must also be run correctly [2] with good controls. We'll save that discussion for another post.

Notes and References

2. U.S. Regulator Is Reviewing Abbott's Fast COVID Test After Studies Raise Accuracy Concerns, NY Times (By Reuters, May 14, 2020).
Abbott Laboratories' ID Now COVID-19 - https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.05.11.089896v1.full.pdf

3. The discover of PCR by Kary Mullis in 1983 led to one half of a 1993 Nobel prize in chemistry, the other half went to Micheal Smith for site directed mutagenesis, which is enabled by PCR. See https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/1993/summary/ for more.

5. Caruthers MH. The chemical synthesis of DNA/RNA: our gift to science. เจ ไบโอล เคม. 2013 Jan 11288(2):1420-7. doi: 10.1074/jbc.X112.442855. PubMed Central PMCID: PMC3543024.

6. Coffin JM, Fan H. The Discovery of Reverse Transcriptase. Annu Rev Virol. 2016 Sep 293(1):29-51. PubMed PMID: 27482900.

7. Kinetic PCR Analysis: Real-time Monitoring of DNA Amplification Reactions (1993)

8. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. Real time quantitative PCR. ความละเอียดของจีโนม 1996 Oct6(10):986-94. PubMed PMID: 8908518.

9. Molecular Beacons: Probes that Fluoresce upon Hybridization (1996)

12. SHERLOCK: Nucleic acid detection with CRISPR nucleases

17. DEVONThink and a software application that stores PDF files, web pages and other documents in a searchable database - available at https://www.devontechnologies.com/

รับทราบ: This work was supported in part by the "START Immuno Biotech" NSF grant (DUE 1700441, Shoreline Community College). Dr. Sandra Porter (Digital World Biology) provided helpful comments and edits.


How to Design PCR Primers

wikiHow เป็น “wiki” คล้ายกับ Wikipedia ซึ่งหมายความว่าบทความของเราจำนวนมากเขียนขึ้นโดยผู้เขียนหลายคน To create this article, volunteer authors worked to edit and improve it over time.

This article has been viewed 14,818 times.

Polymerase Chain Reaction (PCR) is a technique that has various applications in research, medical, and forensic field. It amplifies the DNA fragment of interest. It is also a sensitive test for disease diagnosis and genotyping. The basic ingredients of a reaction system include a DNA template, a buffer solution, deoxyribonucleoside triphosphate (dNTPs), Taq polymerase, and a pair of primers (the forward one and the reverse one). Properly designed primers reduce the cost and time spent on experimentation. Primer-BLAST is a powerful tool to find the primers specific to a template. This tool is free to use and does not require software installation or programming skills. This article demonstrates how to design PCR primers with an example of Primer-BLAST.


The principle of real-time PCR:

The principle of real-time PCR relies on the use of fluorescent dye. In general, the principle of the present method is stated below,

“The amount of the nucleic acid present into the sample is quantified using the fluorescent dye or using the fluorescent labeled oligos.”

Two types of chemistry are available for the real-time quantitative PCR:

  1. DNA binding dye (Intercalating dye-based method)
  2. Sequence-specific probe ( Hydrolysis Probe-based detection method)

How can we decide which method is used for which types of a real-time experiment?

Or can we use both methods for all the samples?

  • What types of experiments we want to perform.
  • The overall cost or the budget of our sample.
  • The knowledge and expertise of the researcher and
  • The tissue type of the sample.

Guanidine Thiocyanate

Guanidine Thiocyanate (Guanidinium thiocyanate or guanidinium isothiocyanate), a powerful protein denaturant, is most often used to inactivate endogenous RNases in the isolation of RNA from various tissues and bacteria. When used with acid-equilibrated phenol or phenol:chloroform, a solution of Guanidine Thiocyanate and beta-mercaptoethanol are very effective in disrupting both cytoplasmic and nuclear membranes while maintaining the integrity of the RNA. In addition, Guanidine Thiocyanate is also used as a storage buffer for blood samples.

*: Prices are for customers in Canada and USA only.


Asymptomatic carrier:

“The asymptomatic carrier for the disease are the intermediate organisms who are infected with the pathogen and do not show symptoms of infection but it can transmit it to other organisms.”

Also known as a “carrier for infection”, pets and animals near to humans like cows, buffalo or pigs are considered as an asymptomatic carrier for so many infections.

In the case of coronavirus, initially, bats were considered as asymptomatic carriers. Then later, scientists found that not bats but pangolin, smuggled from other countries were the asymptomatic carrier of the infection.

Interestingly, previous research indicated that other animals like camels, cats, or bats show the symptoms of the disease as humans. Even though the virus was spread through the intermediate animal hosts, calling them asymptomatic carriers is scientifically not true.

We can say these animals might be the source of infection but are not a carrier.

In another case, children below the age of 12 are considered as carriers. If we analyze the data of coronavirus infection, infected child patients below the age of 12 are less. Therefore, it is presumed that they might be infected but don’t show signs or symptoms.

The infected patient below the age of 12 was also reported in China. No scientific evidence in support of the present assumption is reported to date. Conclusively, neither animals nor children below 12 can be considered as an asymptomatic carrier for infection.


Function of different DNA regions

Not all DNA has the same purpose. There are lots of ways to characterise the difference in function between different regions, but one broad distinction is between that of coding sequences and DNA which is non- coding .

Coding sequences

DNA is called 'coding' if it contributes to the mRNA sequence that will be read by the translation machinery to produce proteins. Coding sequences are found within genes in the form of exons. In some organisms such as humans, the percentage of the genome which consists of coding sequences can be less than 10%. Whilst only representing a small amount of total genetic content, changes in coding sequences – by mutation or genetic engineering – often have a larger effect on cells as they change the structure a protein.

Non-coding DNA

Non-coding DNA refers to sequences that do not contribute directly to protein formation via transcription and translation. These non-coding sequences can have a huge variety of roles:

Regulatory elements: These are DNA sequences which help control the expression of specific genes. Regulatory elements include promoters , which lie just upstream of the coding sequences of genes as well as enhancers , which can be much further away from the genes they control (sometimes as far as 1Mb away).

Introns: Coding sequences within genes are often not present in a single continuous stretch. Instead, different coding sequences that contribute to the same protein are split apart by sequences of non-coding DNA called introns. Through a process called splicing , the coding sequences (exons) of mRNA are stitched together and the introns separating them are removed.


GenScript Press Release about COVID-19

  • Forbes article on Synthetic Bio Companies Racing to Fight Coronavirus here
  • Reuters article: Countries rush to build diagnostic capacity as coronavirus spreads
  • Genetic Engineering & Biotechnology News: Detecting Coronavirus Cases as Outbreak Grows here
  • GenScript is mentioned in a Coronavirus story mostly about Novacyt that was written by Reuters, but picked up by The New York Times here today
  • Medical Device & Diagnostics Online article here
  • LabPulse article here
  • GenomeWeb article here
  • Biospace Blog: China Coronavirus Update: Continued Spread, Run on Antivirals and Facemasks, Baby Diagnosed

To place order or need technical support for coronavirus detection assay, please contact: