ข้อมูล

Mitochondrial ATT (Ile) เริ่ม codons แปลเป็นเมไทโอนีนอย่างไร


ในสัตว์มีกระดูกสันหลังบางชนิด ลำดับโคดอนเริ่มต้นของ mtDNA บางตัวเป็น ATT แต่สิ่งเหล่านี้ถูกแปลเป็นเมไทโอนีนแทนที่จะเป็นไอโซลิวซีน อะไรคือกลไกสำหรับการแปลที่ไม่ได้มาตรฐานนี้?

ตัวอย่างหลักด้านล่างอยู่ในนก นกกระเรียนสีน้ำเงิน (ข้อความที่ตัดตอนมาจาก NCBI Genbank ด้านล่าง) ข้อมูล NCBI ให้บันทึกมาตรฐานเมื่อสิ้นสุด codon หยุด แต่ไม่มีหมายเหตุเกี่ยวกับการปรับเปลี่ยน codon เริ่มต้น เราได้ยืนยัน codon เริ่มต้น ATT นี้จาก PCR-Sager ที่จัดลำดับตัวอย่างอิสระ มีกรณีที่คล้ายกันในสัตว์มีกระดูกสันหลังอื่นๆ (Aves, Squamata, Amphibia) เช่น ND2 ใน Goggia geckos (ตัวอย่างที่ 2 ด้านล่าง ซึ่งได้รับการยืนยันอย่างอิสระโดยการจัดลำดับ Sanger ในสกุลนี้ DNA codon เริ่มต้นจะแตกต่างกันไปตั้งแต่ ATT ถึง ATA หรือ ATC: 50/59 , 6/59, 3/59). ฉันคิดว่าฉันเคยเห็นสิ่งนี้ในยีน mtDNA อื่นๆ ในนกและสัตว์เลื้อยคลานหลายชนิด ND2 เริ่มต้นด้วย ATG

มีการดัดแปลงหลังการถอดเสียงเป็น ATG หรือไม่ ถ้าเป็นเช่นนั้นอย่างไร? พวกเขาสามารถสะท้อนความแตกต่างของรหัส mtDNA โดยที่ AUU = Met ได้หรือไม่ หรือที่ใดก็ตามที่โคดอน AUX ได้รับการยอมรับว่าเป็น Met

ตัวอย่างที่ 1 ND2 จาก Blue Crane (ข้อความที่ตัดตอนมาของ NCBI Genbank refseq)

LOCUS NC_020572 16696 bp DNA วงกลม VRT 18-APR-2013 คำนิยาม Anthropoides paradiseus mitochondrion จีโนมที่สมบูรณ์ ACCESSION NC_020572 VERSION NC_020572.1 DBLINK โครงการ: 193816 BioProject: PRJNA193816 KEYWORDS RefSeq. แหล่งข่าว

ยีน 3970… 5008 /gene="ND2" /db_xref="GeneID:15088361" CDS 3970… 5008 /gene="ND2" /note="TAA stop codon เสร็จสมบูรณ์โดยการเพิ่มเรซิดิว 3' A ลงใน mRNA" / codon_start=1 /transl_except=(pos:5008,aa:TERM) /transl_table=2 /product="NADH dehydrogenase subunit 2" /protein_id="YP_007624320.1" /db_xref="GeneID:15088361" /translation="MNPHAKLIFLTTSLVGTTITISSLAWIPSLAWMSIPLAWNPHLAKLIFLTSLVLGTTITISSLASKILVATLISKLISMA AMKLGLVPFHFWFPEVLQGSSLTTALLLSTVMKFPPITILFLTSHSLNPALLTSMAVA SAALGGWMGLNQTQIRKILAFSSISHLGWMTIIIMYSPKLTLLTFYLYSLMTITVFLT LNTTKALKLSTMMITWTKIPTLNATLMLTLLSLAGLPPLTGFLPKWLIIQELTKQEMT TAATIITMLSLLGLFFYLRLAYYSTITLPPNSTNHMKQWHTDKSTNTLIAIFTSLSAL LLPLSPMILTII" 3901 agtagagtca gctaaaaaag ctatcgggcc cataccccga aaatgatggt ttaacccctt 3961 cctctacta ** TT ** aacccaca tgcaaaacta atcttcctca caagcctagt cctagggaca 4021 accattacaa tctcaagcaa ccattgaata tcagcctgag caggcctaga aatcaatact 4081 ctcgccatta tccccctcat ttcaaaatcc caccacccgc gagccatcga agccgcaatc tagt 4141 aaatatttcc อะคากก์ aaccgcttca gcactagtcc tcttctcaag tataatcaac 4201 gcatgatcta caggacaatg agatattacc caattaaacc aaccaatacc atgcctttta

ตัวอย่างที่ 2 ND2 ใน Goggia (Gekkota, squamata) NCBI nucleotide locus ref.

LOCUS KF666817 1424 bp DNA linear VRT 09-SEP-2014 คำจำกัดความ Goggia lineata voucher MCZ R184778 NADH dehydrogenase subunit 2


จุดสำคัญในการทำความเข้าใจไซต์เริ่มต้นที่ไม่ใช่ AUG ใน mRNA คือลักษณะและบทบาทของตัวเริ่มต้น tRNA

มีตัวเริ่มต้นพิเศษ met-tRNA ซึ่งแตกต่างในโครงสร้างจาก elongator tRNA ทั้งหมดในลักษณะที่ปัจจัยการเริ่มต้นประเภท IF-2 (ไม่ใช่โดย EF-Tu/EF-1) ปัจจัยการยืดตัว) ในคอมเพล็กซ์ที่มีปัจจัยการเริ่มต้นและ GTP มันสามารถจับกับไรโบโซมที่ไซต์ P โดยปกติไรโบโซมจะโต้ตอบกับโคดอน AUG ที่ไซต์ P แต่ในบางกรณี ไรโบโซมจะไม่โต้ตอบกับโคดอน AUG จึงอาจเกิดขึ้นได้

ดังนั้น, กรดอะมิโนที่เริ่มต้นมักจะเป็นเมไทโอนีนโดยไม่คำนึงถึง codon เพราะเมไทโอนีนเป็นกรดอะมิโนเพียงชนิดเดียวที่สามารถชาร์จ tRNA ของตัวเริ่มต้นได้

ในกรณีของ mRNA ของแบคทีเรีย เป็นที่ทราบกันมานานแล้วว่าประมาณ 10% เริ่มต้นด้วย codon อื่น ๆ ซึ่งส่วนใหญ่เป็น GUG สิ่งนี้สามารถอธิบายได้ด้วยตำแหน่งสัมพัทธ์กับตำแหน่งการจับไรโบโซมบน mRNA - ลำดับ Shine และ Dalgarno ฉันคิดว่านี่คือสิ่งที่เกิดขึ้นในไมโตคอนเดรีย

ในกรณีของยูคาริโอต cytoplasmic mRNAs ตัวเริ่มต้น met-tRNA complex โดยทั่วไป สแกนจากปลาย 5ʹ โดยเริ่มต้นที่ AUG แรกหรือ AUG แรกใน 'บริบทที่เหมาะสม' คำจำกัดความที่ชัดเจนของบริบทที่เหมาะสมนั้นไม่ชัดเจน และสามารถจินตนาการได้ว่าในบางกรณีบริบทดังกล่าวจะหยุดไรโบโซมชั่วคราวที่โคดอนที่ไม่ใช่ AUG ซึ่งการเริ่มต้นเริ่มต้นขึ้น

อ้างอิง

“ชีวเคมีของกรดนิวคลีอิก” ฉบับที่ 11 บทที่ 12 (1992) RLP Adams และคณะ - มีข้อมูลอ้างอิงดั้งเดิมที่เก่ากว่าทั้งหมด แต่ไม่ใช่ข้อมูลอ้างอิงล่าสุด

รายการ Wikipedia เกี่ยวกับลำดับ Shine และ Dalgarno

โมเดลการสแกนยูคาริโอต: Hinnebush review (2011)

การเริ่มต้นใน prokaryotes และ eukaryotes Londi review (2015)

ชีววิทยา SE ที่เกี่ยวข้อง คำตอบเกี่ยวกับการเริ่มต้นและการยืดตัว met-tRNAs (โดยฉัน)


รหัสพันธุกรรม

เรียบเรียงโดย Andrzej (Anjay) Elzanowski และ Jim Ostell ที่ National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, Maryland, U.S.A.

อัปเดตรหัสพันธุกรรมครั้งล่าสุด: 7 ม.ค. 2019

NCBI ใช้ความระมัดระวังอย่างยิ่งเพื่อให้แน่ใจว่าการแปลสำหรับลำดับการเข้ารหัสแต่ละรายการ (CDS) ที่มีอยู่ในบันทึก GenBank นั้นถูกต้อง ศูนย์กลางของความพยายามนี้คือการตรวจสอบอย่างละเอียดเกี่ยวกับอนุกรมวิธานของแต่ละเร็กคอร์ดและการกำหนดรหัสพันธุกรรมที่ถูกต้อง (แสดงเป็น /transl_table qualifier บน CDS ในไฟล์แฟล็ต) สำหรับแต่ละสิ่งมีชีวิตและเร็กคอร์ด หน้านี้สรุปและอ้างอิงงานนี้

เรื่องย่อที่นำเสนอด้านล่างมีพื้นฐานมาจากบทวิจารณ์โดย Osawa et al (1992) และ Jukes และ Osawa (1993) อยู่ในวงเล็บเหลี่ยม [] (ใต้ ช่วงที่เป็นระบบ) เป็นการกำหนดเบื้องต้นของรหัสเฉพาะโดยยึดตามความคล้ายคลึงกันของลำดับและ/หรือความสัมพันธ์สายวิวัฒนาการ

เอกสารนี้เวอร์ชัน ASN.1 ของแบบฟอร์มการพิมพ์ ซึ่งรวมถึงรหัสพันธุกรรมทั้งหมดที่ระบุไว้ด้านล่าง มีให้ที่นี่ด้วย ข้อมูลโดยละเอียดเกี่ยวกับการใช้ codon สามารถดูได้ที่ฐานข้อมูลการใช้งาน Codon

รูปแบบ GenBank ตามแบบแผนทางประวัติศาสตร์แสดงลำดับ mRNA โดยใช้ตัวอักษร DNA ดังนั้น เพื่อความสะดวกของผู้ที่อ่านบันทึก GenBank ตารางรหัสพันธุกรรมที่แสดงไว้ที่นี่จึงใช้ T แทน U โคดอนเริ่มต้น - ไม่ว่าจะเป็น AUG, CTG, TTG หรืออย่างอื่น - โดยปริยายจะแปลเป็นเมไทโอนีน (Met, M ). codon intiator ที่เป็นไปได้จะถูกทำเครื่องหมายเป็น 'M' ในแถวที่สอง ('Starts') ของตารางการแปล

ในปัจจุบัน รหัสพันธุกรรมสามารถตั้งค่าได้อย่างอิสระสำหรับนิวเคลียส ไมโทคอนเดรีย พลาสติด และไฮโดรเจนโนโซม การตั้งค่าปัจจุบันสำหรับแต่ละรายการเหล่านี้บนแผนผังการจัดหมวดหมู่สามารถดูได้โดยใช้ปุ่มทั้งสี่ปุ่มใต้รายการรหัสต่อไปนี้


คุณสมบัติของซอฟต์แวร์

รองรับตัวอักษรนิวคลีโอไทด์ที่เสื่อมสภาพ

ซอฟต์แวร์นี้รองรับตัวอักษร IUPAC อย่างสมบูรณ์ ( ตารางที่ 1 ) สำหรับนิวคลีโอไทด์ที่เสื่อมสภาพ ตัวอย่างเช่น codon TCN แปลถูกต้องว่า NS (ซีรีน) และไม่ใช่ NS (ไม่ทราบ) มักพบเห็นในนักแปลคนอื่นๆ

รองรับตารางการแปลที่หลากหลาย

การสนับสนุนอย่างเต็มที่สำหรับตารางการแปลทั้งหมดที่กำหนดโดยกลุ่มอนุกรมวิธาน NCBI ( 5 ) (ดูรายการด้านล่าง) ซอฟต์แวร์เวอร์ชันบรรทัดคำสั่งยังรองรับการอ่านตารางการแปลตามอำเภอใจที่กำหนดโดยผู้ใช้

[2] สัตว์มีกระดูกสันหลัง (ไมโตคอนเดรีย)

[4] เชื้อรา โปรโตซัว โคเอเลนเตรท (ไมโตคอนเดรีย) และไมโคพลาสมา/สไปโรพลาสมา

[5] ไมโทคอนเดรียที่ไม่มีกระดูกสันหลัง

[6] Ciliate, Dasycladacean และ Hexamita (นิวเคลียร์)

[9] เอไคโนเดิร์มและหนอนตัวแบน (ไมโตคอนเดรีย)

[11] แบคทีเรียและพลาสติดพืช

[12] อัลเทอร์เนทีฟยีสต์ (นิวเคลียร์)

[13] แอสซิเดียน ไมโทคอนเดรีย

[14] พยาธิตัวตืดทางเลือก (ไมโตคอนเดรีย)

[16] คลอโรไฟเซียน (ไมโตคอนเดรีย)

[21] ทรีมาโทด (ไมโทคอนเดรีย)

[22] Scenedesmus obliquus (ไมโตคอนเดรีย)

[23] ธรัสโตไคเทรียม (ไมโตคอนเดรีย)

เริ่มและหยุด codons

ไรโบโซมเสมือนยังใช้ตาราง codon การเริ่มต้นการแปลทางเลือก de.ned ในตารางการแปลที่กล่าวถึงข้างต้น รูปที่ 1 เป็นคำจำกัดความของตารางการแปล 11 (รหัสแบคทีเรียและพืช)

ในกรณีนี้ codons TTG , CTG , ATT , ATC , ATA , ATG และ GTG ทั้งหมดได้รับอนุญาตเป็น codon เริ่มต้น และทั้งหมดจะแปลเป็น methionine หากใช้เป็น codon เริ่มต้น [สำหรับรายงานล่าสุดเกี่ยวกับการใช้ GTG เป็นเมไทโอนการเข้ารหัส start-codon โปรดดู ( 6 )] การใช้โคดอนเมไทโอนีนทางเลือกที่ตำแหน่งแรกสามารถปิดใช้งานได้โดยใช้ตัวเลือก 'ภายในทั้งหมด' (มีประโยชน์สำหรับการทำงานกับส่วนย่อยของลำดับ)

นอกจากนี้ ซอฟต์แวร์ยังรองรับการยกเลิกการแปลในครั้งแรกที่พบ Stop codon หรืออ่านลำดับทั้งหมดที่มีคำอธิบายประกอบ stop codon ด้วย ' * ’.

กรอบการอ่านและตัวค้นหา ORF

codon เริ่มต้นที่ 'เข้มงวด' (การเข้ารหัสสำหรับ methionine เสมอ) จะมีคำอธิบายประกอบด้วย ' >>> ' codon เริ่มต้น 'ทางเลือก' (เฉพาะการเข้ารหัสสำหรับ methionine ที่ตำแหน่งเริ่มต้น) จะถูกใส่คำอธิบายประกอบด้วย ' ))) ’ และ Stop codons มีคำอธิบายประกอบด้วย ' *** ’.

คำอธิบายประกอบอินทรอน/เอ็กซอน

นอกจากการทำงานกับไฟล์รูปแบบ FASTA มาตรฐานแล้ว (ลำดับเท่านั้น) Virtual Ribosome ยังเข้าใจรูปแบบไฟล์ TAB สำหรับการมีคำอธิบายประกอบทั้งลำดับและลำดับตามที่อธิบายไว้ใน ( 7 ) โดยย่อ แต่ละบรรทัดในไฟล์รูปแบบ TAB อธิบายหนึ่งลำดับ (DNA หรือเปปไทด์) ในสี่ฟิลด์ โดยคั่นด้วยแท็บ: ชื่อ ลำดับ คำอธิบายประกอบ และข้อคิดเห็น ฟิลด์คำอธิบายประกอบเป็นสตริงที่มีความยาวเท่ากันทุกประการกับฟิลด์ลำดับ แต่ละตำแหน่งในสตริงคำอธิบายประกอบจะอธิบายลักษณะของตำแหน่งที่สอดคล้องกันในสตริงลำดับโดยใช้รหัสตัวอักษรเดียว ไฟล์ TAB ที่มีโครงสร้าง intron/exon สามารถสร้างได้อย่างง่ายดายโดยเซิร์ฟเวอร์ FeatureExtract ( 7 ) หรือโดยการส่งไฟล์ GenBank โดยตรงไปยัง Virtual Ribosome หากส่งไฟล์ GenBank ส่วน CDS (รวมถึงข้อมูลเกี่ยวกับโครงสร้าง intron/exon) จะถูกแยกไปยังรูปแบบ TAB ก่อนการแปล โดยเรียกใช้ซอฟต์แวร์ FeatureExtract ในพื้นหลังพร้อมพารามิเตอร์เริ่มต้น

อีกทางหนึ่งสามารถระบุตำแหน่งและเฟสของอินตรอนได้

ระยะที่ 0: มีอินตรอนอยู่ก่อนโคดอนเข้ารหัสกรดอะมิโน

ระยะที่ 1: มีอินตรอนอยู่ระหว่างตำแหน่ง 1 และ 2 ของโคดอน

ระยะที่ 2: มีอินตรอนอยู่ระหว่างตำแหน่ง 2 และ 3 ของโคดอน

อินเทอร์เฟซที่ใช้งานง่าย

อินเทอร์เฟซไปยังเซิร์ฟเวอร์ Virtual Ribosome ได้รับการออกแบบให้ใช้งานง่ายและใช้งานง่าย รูปที่ 2 แสดงส่วนพื้นฐานของอินเทอร์เฟซ โปรดสังเกตว่า เป็นไปได้ที่จะส่งลำดับการแปลโดยใช้พารามิเตอร์เริ่มต้น โดยไม่ต้องเลื่อนดูหน้าตัวเลือกที่ไม่ชัดเจน ตัวเลือกต่างๆ จะถูกจัดกลุ่มเป็นส่วนตรรกะที่อยู่ด้านล่างของหน้าเว็บ สำหรับแต่ละตัวเลือก จะมีคำอธิบายสั้นๆ พร้อมลิงก์ไปยังคำอธิบายโดยละเอียด

ตัวอักษร IUPAC ของนิวคลีโอไทด์ที่เสื่อมสภาพ

จดหมาย . คำอธิบาย . ฐานที่แสดง
NS อะดีนีน NS
NS ไทมีน NS
NS Guanine NS
ไซโตซีน
Y ไพรมิดีน ซี ทู
NS ปูริน A G
NS แข็งแกร่ง G C
W อ่อนแอ ที่
K คีโต ที จี
NS อะมิโน เอ ซี
NS ไม่ใช่เอ ซี จี ที
NS ไม่ใช่ C เอ จี ทู
ชม ไม่ใช่จี กระทำ
วี ไม่ใช่ T/U เอ ซี จี
NS ใด ๆ A C G T
จดหมาย . คำอธิบาย . ฐานที่แสดง
NS อะดีนีน NS
NS ไทมีน NS
NS Guanine NS
ไซโตซีน
Y ไพรมิดีน ซี ทู
NS ปูริน A G
NS แข็งแกร่ง G C
W อ่อนแอ ที่
K คีโต ที จี
NS อะมิโน เอ ซี
NS ไม่ใช่เอ ซี จี ที
NS ไม่ใช่ C เอ จี ทู
ชม ไม่ใช่จี กระทำ
วี ไม่ใช่ T/U เอ ซี จี
NS ใด ๆ A C G T

ตัวอักษร IUPAC ของนิวคลีโอไทด์ที่เสื่อมสภาพ

จดหมาย . คำอธิบาย . ฐานที่แสดง
NS อะดีนีน NS
NS ไทมีน NS
NS Guanine NS
ไซโตซีน
Y ไพรมิดีน ซี ทู
NS ปูริน A G
NS แข็งแกร่ง G C
W อ่อนแอ ที่
K คีโต ที จี
NS อะมิโน เอ ซี
NS ไม่ใช่เอ ซี จี ที
NS ไม่ใช่ C เอ จี ทู
ชม ไม่ใช่จี กระทำ
วี ไม่ใช่ T/U เอ ซี จี
NS ใด ๆ A C G T
จดหมาย . คำอธิบาย . ฐานที่แสดง
NS อะดีนีน NS
NS ไทมีน NS
NS Guanine NS
ไซโตซีน
Y ไพรมิดีน ซี ทู
NS ปูริน A G
NS แข็งแกร่ง G C
W อ่อนแอ ที่
K คีโต ที จี
NS อะมิโน เอ ซี
NS ไม่ใช่เอ ซี จี ที
NS ไม่ใช่ C เอ จี ทู
ชม ไม่ใช่จี กระทำ
วี ไม่ใช่ T/U เอ ซี จี
NS ใด ๆ A C G T

ภาพหน้าจอของส่วนพื้นฐานของอินเทอร์เฟซ Virtual Ribosome

ภาพหน้าจอของส่วนพื้นฐานของอินเทอร์เฟซ Virtual Ribosome

ขอขอบคุณเป็นพิเศษสำหรับ Ulrik de Licthenberg สำหรับความคิดเห็นเกี่ยวกับเนื้อหาและเลย์เอาต์ของต้นฉบับ และสำหรับ Henrik Nielsen สำหรับแรงบันดาลใจในการนำฟังก์ชัน 'Intron phase' ไปใช้ งานนี้ได้รับการสนับสนุนโดยทุนจากมูลนิธิวิจัยแห่งชาติเดนมาร์กและสำนักงานวิจัยของเดนมาร์ก เงินทุนเพื่อชำระค่าธรรมเนียมสิ่งพิมพ์ของ Open Access สำหรับบทความนี้จัดทำโดย The Danish Research Agency


เมไทโอนีนกำลังเพิ่มขึ้น: ไมโทคอนเดรียเปลี่ยนการใช้โคดอนอย่างไร

tRNA จำเพาะสำหรับเมไทโอนีน (tRNA M et ) ของไมโตคอนเดรียของมนุษย์ประกอบด้วยฟอร์มิล-ไซโตซีนที่ตำแหน่งการวอกแวกของแอนติโคดอนเพื่อให้จับกับ AUG, AUA และ (ในตัวอย่างเดียว) กับ AUU ในฉบับนี้ของ วารสาร EMBO, ฮาก et al ระบุเส้นทางของเอนไซม์สองขั้นตอนที่อำนวยความสะดวกในการปรับเปลี่ยน tRNA ปฏิกิริยาต่อเนื่องของ methyltransferase NSUN3 และ dioxygenase ALKBH1/ABH1 มีความสำคัญในการทำให้ tRNA สามารถจดจำ codon ของ methionine ที่ไม่ใช่ Canonical AUA และ AUUs ซึ่งเป็นคุณสมบัติที่สำคัญสำหรับการสังเคราะห์โปรตีนอย่างมีประสิทธิภาพในไมโตคอนเดรียของมนุษย์

เซลล์ยูคาริโอตมีกลไกการแปลที่แตกต่างกันสองเครื่อง: หนึ่งเครื่องในไซโตซอลและอีกเครื่องหนึ่งในไมโตคอนเดรีย ในขณะที่ไซโตซอลลิกไรโบโซมสังเคราะห์โปรตีนหลายพันชนิดที่แตกต่างกัน ระบบการแปลไมโตคอนเดรียนั้นเชี่ยวชาญในการผลิตโปรตีนเพียงไม่กี่ชนิดเท่านั้น ขนาดของจีโนมยล โดยเฉพาะอย่างยิ่งในสัตว์ (รวมทั้งมนุษย์) ถูกลดขนาดลงจนเกือบจะต่ำสุดตามทฤษฎี 16,569 คู่เบสของรหัสจีโนมไมโตคอนเดรียของมนุษย์สำหรับโปรตีน 13 ชนิด (ทั้งหมดเป็นองค์ประกอบหลักของคอมเพล็กซ์ระบบทางเดินหายใจ) ไรโบโซมอาร์เอ็นเอ 2 ตัว (ตัวหนึ่งสร้างแกนกลางของหน่วยย่อยขนาดใหญ่และอีกหนึ่งแกนของหน่วยย่อยขนาดเล็ก) และ 22 tRNAs ( กุสตาฟสัน et al, 2559 ). ยกเว้นองค์ประกอบควบคุมขนาดเล็กบางรายการที่ควบคุมการถอดความและการจำลองแบบ ลำดับอื่นๆ ทั้งหมดจะถูกลบออกระหว่างวิวัฒนาการ แม้แต่ค่าที่เทียบเท่ากับ 5S rRNA ซึ่งเป็นองค์ประกอบโครงสร้างที่พบในหน่วยย่อยขนาดใหญ่ของไรโบโซมอื่น ๆ ทั้งหมด ก็สูญหายไปในไมโตคอนเดรียของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม และแทนที่ด้วยวาลีน tRNA ที่รวมเข้ากับร่างกายของไรโบโซม (สีน้ำตาล) et al, 2014 ). การลดลงอย่างมากในขนาดจีโนมของไมโตคอนเดรียน่าจะได้รับแรงผลักดันจากวงล้อของมุลเลอร์ นั่นคือ การเลื่อนลอยไปสู่ข้อมูลทางพันธุกรรมที่หลวมอย่างแก้ไขไม่ได้ในจีโนมที่ขาดการรวมตัวกันทางเพศ

ผลที่ตามมาของขนาดจีโนมที่ลดลง ไมโตคอนเดรียของมนุษย์จึงใช้ชุด tRNA ที่เรียบง่าย ซึ่งการชดเชยมักจะถอดรหัสจำนวน codon ที่เพิ่มขึ้น การเปลี่ยนแปลงนี้เห็นได้ชัดใน tRNA Met ซึ่งในการใช้งาน Canonical codon จะรับรู้เฉพาะ AUG codon เท่านั้น อย่างไรก็ตาม ในไมโตคอนเดรียของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม tRNA Met ยังจับกับโคดอน AUA และในบริบทที่ไม่ธรรมดาของโคดอนเริ่มต้นของหน่วยย่อย NADH ดีไฮโดรจีเนส 2 (ND2) รวมถึง AUU ทั้งคู่โดยปกติเข้ารหัสสำหรับไอโซลิวซีน ดังนั้น tRNA Ile เดี่ยวจึงเพียงพอที่จะรวมไอโซลิวซีนทั้งหมดของโปรตีนที่เข้ารหัสไมโตคอนเดรีย โคดอนจำนวนมากขึ้นที่ tRNA Met รู้จัก ส่งผลให้มีปริมาณเมไทโอนีนเพิ่มขึ้นในโปรตีนไมโตคอนเดรีย ระดับสูงของสารตกค้างของกรดอะมิโนที่ออกซิไดซ์ได้ง่ายนี้อาจช่วยต่อต้านสภาวะออกซิเดชันที่เยื่อหุ้มชั้นใน (Bender et al, 2008 ).

จีโนมไมโตคอนเดรียของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมมีอคติที่รุนแรงต่อเนื้อหา AT ที่สูงมาก น่าจะเป็นผลสืบเนื่องมาจากแนวโน้มนี้ 167 จาก 207 เรซิดิวเมไทโอนีนที่เข้ารหัสไมโตคอนเดรียใช้ AUA และมีเพียง 40 รายการเท่านั้นที่ใช้โคดอน AUG ตามรูปแบบบัญญัติ การเพิ่มขึ้นของสเปกตรัม codon ของ mitochondrial tRNA Met เกิดขึ้นได้เนื่องจากการดัดแปลงหลังการถอดเสียงของสารตกค้างของ cytosine ในตำแหน่งวอกแวกของ anticodon (Bilbille) et al, 2011 ) (รูปที่ 1). การศึกษาล่าสุดสามชิ้นระบุเอนไซม์ที่ทำหน้าที่ตามลำดับสองตัว ซึ่งมีหน้าที่ในการดัดแปลงไซโตซีน 34 นี้ (Haag et al, 2016 นาคาโนะ et al, 2016 Van Haute et al, 2559 ). ในขั้นต้น หมู่เมทิลถูกเติมลงในนิวคลีโอไซด์นี้แล้วแปลงต่อไปเป็นกลุ่มฟอร์มิล

รูปที่ 1 anticodon ของ mitochondrial tRNA Met ถูกแก้ไขโดยปฏิกิริยาของเอนไซม์สองปฏิกิริยาตามลำดับ

ในขั้นตอนแรก cytosine 34 ถูกเมทิลบนคาร์บอน 5 (รูปที่ 1) โดย NSUN3 ซึ่งเป็นตัวแทนของไมโตคอนเดรียของแฟมิลี Nol1/Nop2/Sun (NSUN) ของ m5C RNA เมทิลทรานสเฟอเรสสมมุติ จีโนมของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมเข้ารหัสสมาชิกที่มีการอนุรักษ์อย่างสูงอย่างน้อยเจ็ดแห่งของตระกูลโปรตีนนี้เพื่อดัดแปลง RNA ที่แตกต่างกัน ซึ่งส่วนใหญ่เป็น tRNA และ rRNAs ในลักษณะจำเพาะต่อตำแหน่งสูง โดยใช้ ในร่างกาย เชื่อมขวางด้วยแสงยูวีหรือสารเคมี 5-azacytidine, Haag et al ( 2016 ) ระบุว่า NSUN3 เป็นสารยึดเกาะโดยตรงของ tRNA Met ของไมโตคอนเดรีย พวกมันสามารถสร้างปฏิกิริยาเมทิลเลชั่นขึ้นมาใหม่ได้ ในหลอดทดลอง โดยการฟักตัวของ recombinant NSUN3 ต่อหน้า S-adenosylmethionine (SAM) ผู้ให้ที่เป็นหมู่เมทิลด้วย methyl-tRNA ที่คัดลอกมาใหม่ ซึ่งถูก methylated อย่างมีประสิทธิภาพที่ตำแหน่ง cytosine 34 (Haag et al, 2559 ). ในการศึกษาคู่ขนานโดย Van Haute et alผู้เขียนได้ออกแบบการกลายพันธุ์สำหรับการดักจับ NSUN3 ซึ่งมีซิสเทอีนเร่งปฏิกิริยา แต่ไม่มีซิสเทอีนสำหรับการแก้ปัญหาที่จำเป็นสำหรับความแตกแยกของแอดดักต์โควาเลนต์ และด้วยเหตุนี้สำหรับการปล่อย methylated RNA ออกจากเอนไซม์ ด้วยการใช้เครื่องมือที่หรูหรานี้ NSUN3 ถูกจับได้ว่าเป็นมือแดงในกระบวนการผูกมัดกับแอนติโคดอนลูปของไมโตคอนเดรีย tRNA Met (Van Haute et al, 2559 ). Van Haute et al เริ่มมีความสนใจใน NSUN3 เมื่อพวกเขาระบุผู้ป่วยที่มีตัวแปร NSUN3 ที่สูญเสียหน้าที่การทำงาน ผู้ป่วยรายนี้มีอาการของโรคไมโตคอนเดรีย เช่น ภาวะขาด OXPHOS ร่วมกันในเซลล์กล้ามเนื้อเมื่ออายุ 3 เดือน แอนติโคดอนที่ไม่ผ่านการดัดแปลงของไมโตคอนเดรีย tRNA Met (Haag et al, 2016 นาคาโนะ et al, 2016 Van Haute et al, 2016 ) ส่งผลให้อัตราการแปลลดลงอย่างมากในไมโตคอนเดรีย ซึ่งจะทำให้กิจกรรมทางเดินหายใจลดลง (Nakano et al, 2016 ).

The Haag et al การศึกษา (2016) ยังระบุเอนไซม์ที่รับผิดชอบต่อปฏิกิริยาที่สองซึ่งเมทิล-ไซโตซีนที่ตำแหน่ง 34 ของ tRNA Met ถูกแปลงเป็นฟอร์มิล-ไซโตซีนเพิ่มเติม เอนไซม์นี้ ALKBH1/ABH1 เป็นสมาชิกของไดออกซีเจเนสที่ขึ้นกับ AlkB-like Fe 2+ /α-ketoglutarate (ALKBH) ซึ่งรายงานว่าส่วนใหญ่ตั้งอยู่ในไมโตคอนเดรียของเซลล์ HEK293 ในการทดลองสร้างใหม่ การเติม ALKBH1/ABH1 ร่วมกับ Fe 2+ และ α-ketoglutarate จะเปลี่ยน methylated tRNA Met ให้เป็นสปีชีส์ที่จัดรูปแบบที่แพร่หลายภายใต้สภาวะทางสรีรวิทยา ยังไม่ชัดเจนว่า ในร่างกาย, กลุ่มทั้งหมดของ mitochondrial tRNA Met ถูกจัดรูปแบบหรือไม่ว่าจะใช้สถานะดัดแปลงที่แตกต่างกันเพื่อปรับกิจกรรมการแปลของไมโตคอนเดรียหรือไม่

ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา มีการระบุนิวคลีโอไซด์ที่ดัดแปลงมากกว่า 100 สายพันธุ์ใน RNA จากทุกโดเมนของชีวิต (Machnicka et al, 2013 ). การปรับเปลี่ยนหลายอย่างเหล่านี้เปลี่ยนตำแหน่งแรก (โยกเยก) ของแอนติโคดอนของโมเลกุล tRNA เพื่อปรับการรับรู้โคดอน การระบุเอ็นไซม์ที่แสดงการดัดแปลงเหล่านี้เป็นโอกาสที่น่าตื่นเต้นในการคลี่คลายว่าการเปลี่ยนแปลงในรูปแบบการดัดแปลง tRNA แปลเป็นการตั้งค่า codon ที่แตกต่างกันอย่างไร รูปแบบการดัดแปลงที่แตกต่างกันบน tRNA อาจแสดงถึงระดับการควบคุมที่สำคัญเพิ่มเติมโดยที่กิจกรรมการแปลเซลล์สามารถปรับให้เข้ากับความต้องการของเนื้อเยื่อต่างๆ หรือขั้นตอนการพัฒนา (Roundtree & He, 2016 ) การสำรวจ "RNA epigenetics" นี้จะน่าตื่นเต้นในรายละเอียดมากขึ้นในอนาคต


วัสดุและวิธีการ

Α-Complementation และ Split-Intein-GFP assays

สำหรับสายพันธุ์การสอบวิเคราะห์การเติมเต็ม α ถูกบ่มที่ 30°C เป็นเวลา 72 ชั่วโมงบนเพลต SCGal-Ura-Leu+Xgal สำหรับสายพันธุ์ของการทดสอบ Split-Intein-GFP ถูกวิเคราะห์โดยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงคอนโฟคอล วัฒนธรรมยีสต์ที่ปลูกในอาหาร SCD-Ura-Leu ถึง OD600 = 1 ถูกบ่มด้วย 500 นาโนโมลาร์ MitoTracker Red CMXRos (ThermoFisher Scientific) เป็นเวลา 30 นาที อัดเม็ด ล้างสองครั้ง และใส่กลับเข้าไปในอาหารเลี้ยงเชื้อเดียวกัน สารแขวนลอยของเซลล์ถูกติดตั้งบนสไลด์และภาพเรืองแสงถูกถ่ายด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล Zeiss LSM700 พร้อมเลนส์น้ำมันใกล้วัตถุ 100 เท่า และประมวลผลด้วยซอฟต์แวร์ Zen 2009

การแยกเซลล์และการซับแบบตะวันตก

เซลล์ยีสต์ถูกแยกส่วนตามโปรโตคอลการแยกไมโตคอนเดรียของยีสต์ที่ถูกดัดแปลง (35) หกสิบ OD ของเซลล์ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยง ล้างสองครั้งด้วยน้ำกลั่นและแขวนลอยใหม่ใน Tris-SO 100 mM 6 มล.4 pH 9.4, บัฟเฟอร์ DTT 10 mM และบ่มด้วยการเขย่าเป็นเวลา 15 นาทีที่ 30°C เม็ดถูกล้าง 1 ครั้งในซอร์บิทอล 1.2 โมลาร์, 20 มิลลิโมลาร์ KPi pH 7.4, แขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์เดียวกันด้วยไซโมไลเดส T20 10 มก./มล. เซลล์ถูกสร้างทรงกลมที่ 30°C เป็นเวลา 30 นาที และสเฟียโรพลาสต์ถูกแฮสเตอร์โดยการปั่นเหวี่ยงเป็นเวลา 5 นาทีที่ 3000 กรัมที่อุณหภูมิห้อง จากจุดนี้ การดำเนินการทั้งหมดได้ดำเนินการในบัฟเฟอร์ที่เย็นจัด Spheroplasts ถูกล้างด้วยซอร์บิทอล 0.6 M ที่เย็นจัด, 10 mM Tris–HCl pH 7.4 ด้วยตัวยับยั้งโปรตีเอส Complete ULTRA Tablets (Roche) และทำให้เป็นเนื้อเดียวกันโดย 4-5 จังหวะโดยใช้ Potter Homogenizer โฮโมจิเนตถูกปั่นแยกที่ 3000 × g เป็นเวลา 5 นาทีที่ 4°C และส่วนลอยเหนือตะกอนถูกแบ่งออกเป็นสี่เศษส่วน: 1/6 ถูกตกตะกอนด้วย 10% TCA และแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์ตัวอย่างยูเรีย 130 ไมโครลิตร (6 โมลาร์ยูเรีย, 6% SDS, 125 มิลลิโมลาร์ Tris–HCl pH 6.8, 0,01%, 50 mM DTT, Bromophenol Blue) (เศษส่วนทั้งหมด, T) 1/6 และ 2/3 ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 18 000 × g เป็นเวลา 15 นาทีที่ 4°C และเม็ดถูกแขวนลอยใหม่ ใน 130 ไมโครลิตรหรือ 60 ไมโครลิตรของบัฟเฟอร์ตัวอย่างยูเรียตามลำดับ (เศษส่วนของไมโตคอนเดรีย, M และไมโตคอนเดรียหนาแน่น, D) ส่วนลอยเหนือตะกอนจากเศษส่วนของไมโตคอนเดรียถูกตกตะกอนด้วย TCA และแขวนตะกอนใหม่ใน 130 ไมโครลิตรของบัฟเฟอร์ตัวอย่างยูเรีย (เศษส่วนเซลล์, C) ตัวอย่างโปรตีน (20 ไมโครลิตรของเศษส่วนแต่ละส่วน) ได้รับการแก้ไขโดย SDS-PAGE 8%, 10% หรือ 12% และวิเคราะห์โดย western blotting ตามด้วย autoradiography การทำ Western blotting โดยใช้แอนติบอดีต่อ peroxidase-anti-peroxidase (P1291, 1:3000, Sigma) เพื่อตรวจจับ TAP-tag, anti-HA (12CA5, 1:1000, Roche) เพื่อตรวจจับ HA-tag และ polyclonal custom-raised แอนติบอดีจำเพาะ anti-Ilv2, anti-Sgt2 และ anti-Trr1 แอนติซีรา IgG ต่อต้านเมาส์เชิงพาณิชย์รองในเชิงพาณิชย์ (31 430, 1:25 000, Thermo Fisher Scientific) ถูกใช้ต่อต้านแอนติบอดีต้าน HA และแอนติ-ซีรา IgG ฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดสคอนจูเกตที่ผสานกับกระต่าย (A0545, 1:10 000, Sigma ) ต้านแอนติบอดีต้าน Ilv2, ต้าน Sgt2 และต้าน Trr1

เศษส่วนยลหยาบของ มี1Δ สายพันธุ์ที่แสดงแวเรียนต์ Has1 wt และ Has1 mf ถูกแยกตามที่อธิบายไว้ (36) ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดยการทดสอบแบรดฟอร์ดและสารสกัดโปรตีนยล 5 ไมโครกรัมถูกวิเคราะห์โดย SDS-PAGE และ Western blotting MTCO1 MTCO2 MTCO3 (ab110270, ab110271, ab110259 1:1000, Abcam, UK) ถูกใช้เป็นแอนติบอดีหลักในการตรวจหาโปรตีน Cox1, Cox2 และ Cox3 ตามลำดับ แอนติบอดีต่อต้าน VDCA1 (ab14734, 1:1000, Abcam) ถูกใช้เป็นโหลด กลุ่มควบคุมและต่อต้านเมาส์-HRP (W4021, 1:3333, Promega) เป็นแอนติบอดีทุติยภูมิ

การวิเคราะห์ชีวสารสนเทศ

หน้าจอ NTE

รูปแบบ N-terminally extended protein (NTE) ถูกทำนายโดยใช้แพ็คเกจ MitoCrypt R ที่พัฒนาขึ้นเพื่อจุดประสงค์นี้และอยู่ภายใต้ UTR: https://github.com/Miswi/MitoCrypt ยูทิลิตี้หลักของแพ็คเกจนี้รวมถึงการทำนาย aTIS, การตัดซอฟต์แวร์ทำนาย MTS และพล็อตโปรไฟล์ไซต์ ribosomeA Saccharomyces cerevisiae ไฟล์ลำดับจีโนม FASTA และไฟล์หมายเหตุประกอบของยีน GTF (รูปแบบการถ่ายโอนทั่วไป) ถูกแยกจากที่เก็บ Ensembl (ensembl.org) รีลีส 94 ( 37) แยกลำดับ พิกัดจีโนม และคุณสมบัติอื่นๆ ของไอโซฟอร์ม NTE ที่อาจเกิดขึ้นได้โดยใช้สคริปต์ R ที่กำหนดเองโดยใช้แพ็คเกจ R วัตถุประสงค์ทั่วไปที่ใช้กันทั่วไป (dplyr, tibble) รวมถึงแพ็คเกจ R ทางชีวภาพที่ออกแบบมาสำหรับการจัดการข้อมูลลำดับ (Biostrings, refGenome) และการพึ่งพาทั้งหมด ( 38–42) การค้นหา TIS ที่เป็นไปได้ทั้งหมดได้ดำเนินการโดยการกรอง triplets ใกล้ cognate ในเฟรมอัปสตรีมทั้งหมด: CUG, GUG, UUG, ACG, AUA, AUC, AUU (27) และ AUG ต้นน้ำ (uAUG) ที่ไม่ได้แยกจาก ORF หลักโดย codon หยุดในเฟรม พบไอโซฟอร์มที่ตัดปลาย N (NTT) โดยการค้นหา ORF ทั้งหมดสำหรับโคดอน AUG ภายในเฟรม อาร์เรย์ของไอโซฟอร์มที่เป็นไปได้ต่อเนื่องกันถูกสร้างขึ้นโดยการแปลลำดับจีโนมของดีเอ็นเอสำหรับพิกัดของบริเวณที่ขยายออกไปในลักษณะย้อนกลับ โดยจัดเก็บตัวเลือกที่เป็นไปได้ทั้งหมดโดยอิงตาม aTIS ที่วิเคราะห์แล้วต่อด้วยลำดับ ORF ที่แปลด้วยคำอธิบายประกอบดั้งเดิม ข้อมูลความแตกต่างของการถอดรหัสตาม (43) ถูกเพิ่มเป็นข้อมูลเพิ่มเติมสำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติม รายการยีนที่มีความมั่นใจสูงถูกสร้างขึ้นโดยการกรองคุณสมบัติที่ไม่ได้รับการยืนยันตามคำหลัก: 'ผสาน', 'ลบ' และ 'ORF ที่น่าสงสัย' โดยไม่มีการระบุการแปลในข้อมูล Ribo-seq ไอโซฟอร์มที่ไม่ครอบคลุมโดยข้อมูลทรานสคริปต์ (43) ถูกแยกออกจากการวิเคราะห์ Ribo-seq เพิ่มเติม เอาต์พุตของแพ็คเกจ MitoCrypt สามารถแสดงผลได้ด้วยเบราว์เซอร์จีโนม เช่น โปรแกรมดูจีโนมเชิงบูรณาการ (44) ในทุกขั้นตอนของการประมวลผลและวิเคราะห์ข้อมูล ข้อมูลจะถูกจัดเก็บในรูปแบบตารางตามรูปแบบ UCSC BED (Browser Extensible Data) ( 45)

การวิเคราะห์ข้อมูล Ribo-seq

การวิเคราะห์ข้อมูล Ribo-seq ดำเนินการกับชุดข้อมูล RNAse I ที่ปราศจากยาปฏิชีวนะสำหรับยีสต์ในระยะการเจริญเติบโตแบบทวีคูณ (46–49) โปรไฟล์การครอบครองไรโบโซมความละเอียดย่อยของโคดอนถูกสร้างขึ้นโดยใช้แพ็คเกจ Scikit-Ribo ซึ่งช่วยให้สามารถทำแผนที่รอยเท้าที่แม่นยำ (50) วิธีการนี้ยังอนุญาตให้มีการเลือกปฏิบัติระหว่าง uORF และ NTE เนื่องจากจะใช้เฉพาะการอ่านในเฟรมเท่านั้นสำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติม โปรไฟล์จากชุดข้อมูลทั้งหมดถูกต่อเป็นโปรไฟล์ RPKM (ไรโบโซมต่อกิโลเบสต่อการอ่านที่แมปหนึ่งล้านครั้ง) เพื่อทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับความลึกของลำดับที่แตกต่างกัน พล็อตโปรไฟล์การครอบครองไรโบโซมถูกสร้างขึ้นด้วยสคริปต์ R แบบกำหนดเองและแพ็คเกจ ggplot ( 51) สำหรับการเรียก TIS โปรไฟล์ไรโบโซมที่มีตั้งแต่ปลายน้ำ aTIS ที่เป็นไปได้มากที่สุดของโคดอน AUG เริ่มต้นที่ทำหมายเหตุประกอบไว้ ไปจนถึงโคดอนหยุดที่มีคำอธิบายประกอบสำหรับ ORF ของยีสต์ทั้งหมดถูกสร้างขึ้น ยีนที่มีไรโบโซมครอบครองต่ำเกินไป (เลือกโดยพลการที่ 1 RPKM) ถูกนำออกจากการวิเคราะห์เพิ่มเติม แต่ละโปรไฟล์อยู่ภายใต้อัลกอริธึมที่ใช้ R ซึ่งอธิบายไว้ในรูปที่ S1 เพิ่มเติม ค่าเฉลี่ยการครอบครองไรโบโซมได้รับการทดสอบโดยใช้การเรียงสับเปลี่ยน NS- ทดสอบ (ซ้ำ 10,000 ครั้ง) ด้วย 0.05 NSเกณฑ์มูลค่า เมื่อทดสอบไอโซฟอร์มหลักเพียง 50 โคดอนแรกเท่านั้นที่ถูกนำมาพิจารณาเพื่อหลีกเลี่ยงการประเมินประสิทธิภาพการแปลต่ำเกินไป


วัสดุและวิธีการ

การเก็บตัวอย่าง การสกัด DNA การขยายและการโคลน

ตัวอย่างของ ก. เนปจูน (Sollas, 1886) (Class Demospongiae: Order Astrophorida: Family Geodiidae) เก็บรวบรวมจากแนวปะการังเทนเนสซี ฟลอริดาคีย์ส รัฐฟลอริดา ที่ความลึก 15 เมตร และของ T. actinia (de Laubenfels, 1950) (Class Demospongiae: Order Hadromerida: Family Tethyidae) เก็บจากรากไม้ชายเลนใน Zane Grey Creek, Long Key, Florida บัตรกำนัลของฟองน้ำถูกเก็บรักษาไว้ในเอทานอล 70% สำหรับการประมวลผลทางเนื้อเยื่อวิทยาและการระบุอนุกรมวิธาน ส่วนของฟองน้ำแต่ละอันถูกเก็บแช่แข็งหลังจากการเติมสารละลายกัวนิดิเนียม คลอไรด์ 8 โมลาร์ในบัฟเฟอร์ TE (10 มิลลิโมลาร์ ทริส, 1 มิลลิโมลาร์ EDTA, pH 8) ดีเอ็นเอทั้งหมดถูกเตรียมจากตัวอย่างแต่ละชิ้น ∼1 ซม. 3 ชิ้นโดยการสกัดฟีนอล-คลอโรฟอร์มหลังจากการย่อยโปรตีนเค ภูมิภาคของ cox1 และ rnl ได้รับการขยายโดยใช้ไพรเมอร์ HCO, LCO, 16S-ARL และ 16S-BRH ( Folmer et al. 1994 Hillis, Moritz และ Mable 1996) ตรวจสอบกับฐานข้อมูล GenBank เพื่อแยกความเป็นไปได้ของการปนเปื้อน และใช้ในการออกแบบไพรเมอร์เฉพาะสำหรับ ภูมิภาคเหล่านี้ mtDNA ที่สมบูรณ์จากทั้งสองสปีชีส์ถูกขยายออกเป็นสองส่วนซ้อนทับกันโดยใช้ชุด TaKaRa LA-PCR ภายใต้เงื่อนไขที่แนะนำ ไลบรารีโคลนแบบสุ่มถูกสร้างขึ้นจากผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสบริสุทธิ์ (PCR) โดยการพ่นละอองให้เป็นชิ้นเล็กชิ้นน้อยขนาด 1–3 kbp ( Okpodu et al. 1994) และโดยการโคลนพวกมันเป็นเวกเตอร์ pBluescript II KS+ ที่ดัดแปลงด้วยไซต์มัลติโคลนที่สั้นลง ( พีบีเอฟแอล) เวอร์ชันดัดแปลงของไพรเมอร์ยูคาริโอตสากล A และ B ( Medlin et al. 1988) ถูกนำมาใช้สำหรับการขยายยีน rRNA ย่อยของหน่วยย่อยนิวเคลียร์ขนาดเล็ก (SSU-rRNA) จากทั้งสองสปีชีส์

การจัดลำดับ การประกอบ และการระบุยีน

โคลนถูกจัดลำดับบนซีเควนเซอร์อัตโนมัติ Li-Cor (Lincoln, Nebr.) และประกอบโดยใช้ชุดซอฟต์แวร์ STADEN ( Staden 1996) บริเวณที่มีปัญหาและมีบทบาทน้อยในลำดับ mtDNA ที่ประกอบกัน รวมทั้งยีน SSU-rRNA ของนิวเคลียร์ถูกจัดลำดับโดยตรงจากผลิตภัณฑ์ PCR โดยการเดินไพรเมอร์ ยีน tRNA ถูกระบุโดยโปรแกรม tRNAscan-SE ( Lowe และ Eddy 1997) ยีนอื่น ๆ ถูกระบุโดยการค้นหาความคล้ายคลึงกันในฐานข้อมูลท้องถิ่นโดยใช้โปรแกรม FASTA (Pearson 1994) และใน GenBank ที่ NCBI โดยใช้บริการเครือข่าย Blast ( Benson et al. 2003 ). โครงสร้างรองของยีน rRNA ได้มาจากการเปรียบเทียบกับโครงสร้างยีน rRNA อื่นๆ ที่เผยแพร่ และวาดโดยใช้โปรแกรม RnaViz 2 ( De Rijk, Wuyts และ De Wachter 2003) ลำดับ SSU-rRNA ของไมโตคอนเดรียและนิวเคลียร์บางส่วนมีให้ผ่านทางหมายเลขภาคยานุวัติของ GenBank AY_320032, AY_320033 และ AY878078, AY878079 ตามลำดับ

การวิเคราะห์ลำดับ

สำหรับการวิเคราะห์ความแตกต่างของลำดับ ยีนแต่ละตัวถูกจัดชิดกับ ClustalW 1.82 ( Thompson, Higgins และ Gibson 1994) โดยใช้การจัดตำแหน่งพารามิเตอร์เริ่มต้นถูกปรับด้วยตนเองตาม (1) การจัดตำแหน่งกรดอะมิโน (สำหรับยีนที่มีการเข้ารหัสโปรตีน) หรือ (2) อนุมาน โครงสร้างรอง rRNA หรือ tRNA (สำหรับยีนเข้ารหัส RNA) ความแตกต่างของลำดับที่สังเกตพบถูกคำนวณเป็นเปอร์เซ็นต์ของนิวคลีโอไทด์ที่ไม่ตรงกันในการจัดแนว ระยะทางตามคู่ Tamura-Nei ถูกกำหนดโดยใช้ PAUP*4.0b10 (Swofford 2002)

การวิเคราะห์สายวิวัฒนาการของข้อมูลโปรตีน

ลำดับกรดอะมิโนของโปรตีนแต่ละชนิดถูกจัดตำแหน่งสามครั้งโดยใช้ ClustalW 1.82 ( Thompson, Higgins และ Gibson 1994) ที่มีการรวมกันที่แตกต่างกันของการลงโทษช่องว่างส่วนขยายการเปิด: 10/0.2 (ค่าเริ่มต้น), 12/4 และ 5/1 สำหรับการจัดแนวสุดท้าย ไม่มีการเพิ่มโทษช่องว่างใกล้กับช่องว่างที่มีอยู่ ไม่มีการลดช่องว่างที่ลดลงในการยืดที่ชอบน้ำ และไม่มีการใช้บทลงโทษจำเพาะเรซิดิว การจัดตำแหน่งทั้งสามถูกเปรียบเทียบโดยใช้ SOAP ( Löytynoja และ Milinkovitch 2001) และตำแหน่งที่เหมือนกันในหมู่พวกเขาถูกรวมไว้ในการวิเคราะห์สายวิวัฒนาการ ชุดข้อมูลสุดท้ายที่ต่อกันคือความยาวกรดอะมิโน 2,865 ตัว

เราทำการค้นหาความเป็นไปได้สูงสุดสำหรับทรีที่ดีที่สุดตามที่นำมาใช้ในโปรแกรม PHYML ( Guindon และ Gascuel 2003) โดยใช้แบบจำลองแกมมา + ค่าคงที่ที่มีแปดหมวดหมู่ ประมาณค่าพารามิเตอร์ α เมทริกซ์ mtREV ของการแทนที่กรดอะมิโน และประมาณความถี่ ของกรดอะมิโน การจำลองบูตสแตรปนับร้อยรายการถูกสร้างขึ้นโดยโปรแกรม SEQBOOT ภายในแพ็คเกจ PHYLIP ( Felsenstein 2002) และวิเคราะห์ตามข้างต้น การอนุมานแบบเบย์ (MB) ใช้ MrBayes 3.0b4 ( Ronquist และ Huelsenbeck 2003) เราดำเนินการโซ่ Markov Chain Monte Carlo สี่ชุดสำหรับ 110,000 รุ่น โดยใช้แบบจำลอง mtREV ของการแทนที่กรดอะมิโนด้วยอัตราการกระจายแกมมา + ค่าคงที่ สุ่มตัวอย่างต้นไม้ทุก ๆ รอบที่ 10 หลังจากรอบการเผาไหม้ 4,000 รอบแรก


RNA codons กำหนดกรดอะมิโนจำเพาะ ลำดับเบสในลำดับโคดอนกำหนดกรดอะมิโนที่จะผลิต นิวคลีโอไทด์สี่ตัวใดในอาร์เอ็นเออาจครอบครองตำแหน่งโคดอนที่เป็นไปได้หนึ่งในสามตำแหน่ง ดังนั้นจึงมีชุดค่าผสม codon ที่เป็นไปได้ 64 ชุด โคดอนหกสิบเอ็ดตัวระบุกรดอะมิโนและสาม (UAA, UAG, UGA) ทำหน้าที่เป็น สัญญาณหยุด เพื่อกำหนดจุดสิ้นสุดของการสังเคราะห์โปรตีน โคดอน สิงหาคม รหัสสำหรับกรดอะมิโน เมไทโอนีน และทำหน้าที่เป็น สัญญาณเริ่มต้น สำหรับการเริ่มต้นการแปล

โคดอนหลายตัวอาจระบุกรดอะมิโนตัวเดียวกันได้เช่นกัน ตัวอย่างเช่น codon UCU, UCC, UCA, UCG, AGU และ AGC ล้วนระบุถึงซีรีนของกรดอะมิโน ตารางโคดอน RNA ด้านบนแสดงรายการชุดค่าผสมของโคดอนและกรดอะมิโนที่กำหนด อ่านตาราง ถ้า uracil (U) อยู่ในตำแหน่ง codon แรก, adenine (A) อยู่ในตำแหน่งที่สอง และ cytosine (C) อยู่ในตำแหน่งที่สาม codon UAC จะระบุกรดอะมิโนไทโรซีน


Mitochondrial ATT (Ile) เริ่ม codons แปลเป็นเมไทโอนีนอย่างไร - ชีววิทยา

หลักคำสอนหลักของอณูชีววิทยาอธิบายกระบวนการแปลยีนเป็นโปรตีน ลำดับเฉพาะของ DNA ทำหน้าที่เป็นแม่แบบในการสังเคราะห์ mRNA

The start codon is the first codon of a messenger RNA (mRNA) transcript translated by a ribosome. The start codon always codes formethionine in eukaryotes and a modified Met (fMet) in prokaryotes. The most common start codon is AUG.

The start codon is often preceded by an untranslated region 5' UTR. In prokaryotes this includes the ribosome binding site.

Alternate start codons (non AUG) are very rare in eukaryotic genomes. Mitochondrial genomes and prokaryotes use alternate start codons more significantly (mainly GUG and UUG). For example E. coli uses 83% AUG (3542/4284), 14% (612) GUG, 3% (103) UUG [1] and one or two others (e.g., an AUU and possibly a CUG). [2] [3] Bioinformatics programs usually allow for alternate start codons when searching for protein coding genes. [ ต้องการการอ้างอิง ]

Note that these alternate start codons are still translated as Met when they are at the start of a protein (even if the codon encodes a different amino acid otherwise). This is because a separate transfer RNA (tRNA) is used for initiation.

Well-known coding regions that do not have AUG initiation codons are those of lacI (GUG) [4] [5] and lacA (UUG) [6] in the อี. โคไล lac operon.


วัสดุและวิธีการ

Annotated mitochondrial protein-coding genes available for 29 representatives of Sphaeropleales were downloaded directly from GenBank ( supplementary table S1 , Supplementary Material online). Seven additional sphaeroplealen mitogenomes that lacked annotation completely or the annotation was incomplete (Stauridium tetras, Coelastrum sp. F187, Coelastrella sp. M60, Coelastrella sp. UTEX B 3026, Graesiella sp. 549, Kirchneriella aperta, และ Monoraphidium neglectum supplementary table S1 , Supplementary Material online) were annotated by manual curation of the output of the MFannot tool (http://megasun.bch.umontreal.ca/cgi-bin/mfannot/mfannotInterface.pl) employing the “Scenedesmus obliquus Mitochondrial Code” (NCBI translation table 22, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi#SG22). Genes associated with mobile genetic elements or being limited to particular taxa (“ORFans”) were excluded, the remaining genes were sorted (based on existing annotation confirmed by similarity searches) into 13 groups of orthologs representing standard mitochondrial genes encoding components of the respiratory chain complexes or the ATP synthase ( supplementary table S1 , Supplementary Material online). Mitogenome-encoded protein sequences of other 995 diverse eukaryotic taxa were gathered from GenBank, deliberately omitting from the sample Metazoa, แซคคาโรไมซิส เอสพีพี และ พลาสโมเดียม เอสพีพี represented by overwhelming numbers of sequenced mitogenomes that could bias the pattern of amino acid conservation at homologous protein positions. These sequences were searched with BlastP ( Altschul et al. 1997) against the standard mitochondrial protein sequences from Sphaeropleales to identify putative orthologs. Those sequences having all 10 best hits to sphaeroplealean sequences representing the same gene with e-value lower than 1e-30 were considered putative orthologs. No nonsphaeroplealean sequences met these criteria for the atp6 gene, owing to its high divergence in Sphaeropleales. Orthologous protein sequences (for paneukaryotic or Sphaeropleales-only alignments) were aligned using MAFFT v7.407 with –auto option ( Katoh and Standley 2013). Analyses of codon occurrence at conserved positions in the alignments were performed by using custom Python scripts (available upon request from the corresponding author). Sequence alignments analyzed are available (as a zipped file) at the following URL: http://www1.osu.cz/∼elias/Mitochondrial_genetic_codes_Sphaeropleales.zip. FACIL and CoreTracker analyses were performed using default settings and nucleotide sequences of the 13 conserved mitochondrial genes.

For consistency, tRNA genes in sphaeroplealean mitogenomes were (re)annotated by using tRNAscan-SE v2.0 with the -O (organellar) option ( Lowe and Eddy 1997). The amino acid specificity of the tRNAs was assessed with tRNAscan-SE employing the bacterial models (an organelle-specific option is not available for such an analysis). A multiple alignment of tRNA sequences (excluding six highly divergent ones with uncertain functionality) was computed using LocARNA ( Will et al. 2012). After manual alignment trimming (to remove poorly conserved regions), a phylogenetic tree was inferred with the maximum likelihood (ML) method implemented in MEGA X v10.0.5 ( Kumar et al. 2018), using the GTR+G model and 100 bootstrap replications. tRNA secondary structures were modeled with tRNAscan-SE and visualized with VARNA v3-93 ( Ponty and Leclerc 2015). For comparison of the genomic location of tRNA genes, mitogenome sequences from GenBank were reannotated for consistency with MFannot (with genetic code table 22), the genomic maps were visualized with OrganellarGenomeDRAW ( Greiner et al. 2019) and further modified for graphical presentation by using Inkscape 0.92.4 (https://inkscape.org/).

The phylogenetic relationships of the Sphaeropleales representatives analyzed were reconstructed from nucleotide sequences of the 13 conserved mitochondrial genes ( supplementary table S1 , Supplementary Material online). The alignments were built at the level of amino acid sequences using MUSCLE v3.8.425 ( Edgar 2004) and converted to corresponding nucleotide sequence alignments using AliView software v1.25 ( Larsson 2014) and the translation table 22. The alignments were manually trimmed and concatenated with a custom Python script, yielding 11,124 aligned nucleotide positions. The ML phylogenetic tree was inferred using IQ-TREE v1.6.9 ( Nguyen et al. 2015) with 100 non-parametric bootstraps and the “auto” model selection option (which chose GTR+F + I+G4 as the best model).

Homologs of mitochondrial release factors were searched with TBlastN in genome and transcriptome assemblies available in NCBI databases and in the transcriptome assemblies provided by the OneKP project (https://db.cngb.org/onekp/). A partial mRF1a sequence from Hariotina reticulata was assembled from RNAseq Illumina reads available in the SRA database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra). In case of the unannotated mRF1a gene from Coelastrella sp. UTEX B 3026, the gene mode (exon-intron structure) was deduced manually by considering sequence conservation and canonical intron splice sites GT and AG. All sequences were identified by BlastP searches as orthologs of the sole chlorophyte mitochondrial release factor mRF1a (details on the sequences are provided in supplementary table S5, Supplementary Material online). The sequences were aligned with MAFFT v7.407 (–auto option), the alignment was converted into the svg format with Jalview v2.10.15 ( Waterhouse et al. 2009) and further modified with vector graphics software Inkscape 0.92.4.


การอภิปราย

In the present study, we have investigated the mechanism responsible for the dual targeting of Arabidopsis thaliana THI1 to mitochondria and chloroplasts, using a combination of in vitro transcription/translation experiments and in vivo GFP expression in tobacco leaf protoplasts.

The finding that thi1 contains a single mRNA excludes the possibility of transcript heterogeneity, which could result in the production of proteins with variable N-termini. In vitro transcription/translation experiments showed that thi1 produces two translational products with the expected size for translation initiation for the two in-frame AUG start codons. Interestingly, analysis of the vicinity of both start codons indicates that the sequence context around the first AUG (NSAA AUG NSC) is more favorable for translation initiation than the second (NSAG AUG NSC), as it corresponds to the reported dicot consensus (NS/GAA AUG NSC) (Joshi et al., 1997 Lukaszewicz et al., 2000). A purine, preferably A, at position -3 (three nucleotides before the AUG codon, which is numbered +1 to +3), and G at position +4, are the major determinants for translation initiation efficiency in higher plants (Kozak, 1991 Kozak, 1997). We reasoned that the observed low translation levels at the second AUG may, somehow, be related to a reduced demand for the shorter translational product inside the cell.

Since THI1 presents two targeting sequences in tandem, we hypothesized that translation initiation in the first AUG would deliver the protein to chloroplasts. In addition, the presence of a second in-frame AUG at the beginning of a sequence able to fold into an amphiphilic α-helix, and usually found in mitochondrially imported proteins (Neupert, 1997), suggested that this codon could be a site for translation initiation. The presence of both in-frame AUG codons fused to the 5′ end of GFP directed translocation of the reporter protein to mitochondria and chloroplasts of tobacco leaf protoplasts. Supporting evidence for this mechanism was obtained from the observation that mutation in the first AUG to AUC abolished importation of GFP to chloroplasts, and the fluorescent protein was found to be only associated with mitochondria. Thus, the second AUG can also be recognized in vivo by the plant translation machinery and the product indeed delivered to mitochondria. In accordance with this, the construct starting directly from the second in-frame AUG fused to GFP confirmed that this amphiphilic α-helix secondary structure functions as a mitochondrial presequence. Another important result was obtained by the conversion of the second in-frame AUG to AUC: GFP was then found associated to the plastids and the targeting to mitochondria completely lost. The fact that GFP was targeted specifically to particular organelles is not direct proof of targeting, but does provide strong evidence that the different isoforms of THI1 are produced in vivo and that a translational initiation mechanism is involved in the dual targeting of this protein.

According to the scanning model, translation is initiated at the first AUG codon contained in a particular context (Kozak, 1991). Why would translation initiation occur at the second AUG of thi1 mRNA if its context were not favored? It has been suggested that initiation sites in eukaryotic mRNAs are reached via a scanning mechanism that predicts that translation should start at the AUG codon nearest the 5′ end of the mRNA (Kozak, 1999). However, a recent survey on translation initiation in vertebrates indicates that translation initiation from downstream AUGs is more common than generally believed (Peri and Pandey, 2001). It is suggested that mechanisms such as leaky scanning, reinitiation or internal initiation of translation might have a greater role than previously reported (for a review, see Gray and Wickens, 1998). Translation at the second AUG, in which the surrounding sequence is not suitable for efficient initiation, might indicate a leaky scanning mechanism, where the ribosome does not always recognize the initial AUG. อีกทางหนึ่ง thi1 mRNA contains short complementary matches to 18S rRNA, raising the possibility that ribosome recruitment at some cellular IRESes might occur by base pairing between thi1 mRNA and 18S rRNA. Placing these observations together, translation of both in-frame start codons would involve a cap-dependent translation mechanism around the first AUG and a cap-independent translation process at the second start codon. Although speculative, these assumptions can be tested experimentally. Further studies are necessary to determine the mechanism for initiating translation of Arabidopsis thaliana thi1 เอ็มอาร์เอ็นเอ

Although the function of THI1 in mitochondria and chloroplasts is not completely understood, it seems that THI1 requirement is increased in chloroplasts. In fact, thiamine biosynthesis has been associated to plastids, where it participates as a cofactor for the two enzyme complexes involved in the citric acid cycle, pyruvate dehydrogenase and α-ketoglutarate dehydrogenase (Belanger et al., 1995). The need for thiamine is thus essential for plant metabolism, which suggests that the enzymes involved in its biosynthetic pathway are required at high levels. On the other hand, it has been suggested that THI1 has a second role in protecting mitochondrial DNA from damage (Machado et al., 1996 Machado et al., 1997). One reasonable possibility is that THI1 participates in independent reactions in two organelles at different requirements. Evaluation of the precise role of THI1 in mitochondria and chloroplasts would certainly help in understanding the differential requirements of this protein and its effect on translation regulation.