ข้อมูล

เป็นไปได้ไหมที่จะแทรก DNA โดยไม่ตัดไซต์การจดจำด้วย CRISPR/Cas9?


เรากำลังมองหาวิธีที่จะแทรก DNA เข้าไปในจีโนม แต่เราต้องการที่จะทำในลักษณะที่ไซต์การจดจำยังคงไม่บุบสลายเพื่อให้สามารถเพิ่ม DNA อีกครั้งในตำแหน่งเดิมได้ คุณรู้หรือไม่ว่าเป็นไปได้หรือเป็นไปตามที่ CRISPR/Cas9 ทำอยู่แล้ว? เห็นได้ชัดว่าระบบหลายระบบได้รับการออกแบบมาแล้ว แต่เอกสารบางส่วนที่เราอ่านไม่เกี่ยวกับปัญหาของเรา

ขอแสดงความนับถือ,

เอมิลี่


ดูการรวมตัวกันใหม่เฉพาะไซต์ คุณสามารถใช้ recombinase เฉพาะไซต์ โดยเฉพาะอินทิเกรส ที่สามารถแทรกลำดับของ DNA ที่ไซต์ที่แนบบางไซต์ได้ คุณสามารถเพิ่มไซต์แนบที่เหมือนกันลงในลำดับ DNA เพื่อแทรก เพื่อให้สามารถรวมไซต์สิ่งที่แนบมาใหม่ได้ อย่างไรก็ตาม โปรดทราบว่าคุณอาจได้รับ SSR บนพลาสมิดการแทรก ดังนั้นอย่าทำเช่นนี้หากคุณต้องการรวมจำนวนเฉพาะ

ดูที่รูปย่อยด้านล่างของ A สำหรับตัวอย่างของการรวม Recombinases ยังสามารถทำสิ่งอื่น ๆ เช่นการตัดตอนและการผกผันตามการวางแนวของไซต์ที่แนบ


คณิตศาสตร์อธิบายว่าทำไม Crispr-Cas9 ถึงตัด DNA ผิดบางครั้ง

เครดิต: TU Delft

การค้นพบโปรตีน Cas9 ทำให้การแก้ไขยีนง่ายขึ้น และอาจทำให้สามารถกำจัดโรคทางพันธุกรรมจำนวนมากได้ในอนาคตอันใกล้ การใช้ Cas9 นักวิจัยมีความสามารถในการตัด DNA ในเซลล์เพื่อแก้ไขยีนที่กลายพันธุ์ หรือวางสารพันธุกรรมชิ้นใหม่ลงในจุดที่เพิ่งเปิดใหม่ ในขั้นต้น ระบบ Crispr-Cas9 ดูเหมือนจะแม่นยำอย่างยิ่ง อย่างไรก็ตาม เป็นที่ชัดเจนว่าบางครั้ง Cas9 ยังตัดลำดับ DNA อื่นๆ ที่คล้ายกับลำดับที่โปรแกรมไว้กำหนดเป้าหมาย นักวิทยาศาสตร์จาก Delft University of Technology ได้พัฒนาแบบจำลองทางคณิตศาสตร์ที่อธิบายว่าทำไม Cas9 จึงตัดลำดับ DNA บางส่วนออกไปในขณะที่ปล่อยให้ผู้อื่นอยู่ตามลำพัง

ระบบ Crispr-Cas9 เป็นกลไกป้องกันที่ปกป้องแบคทีเรียจากไวรัส หากไวรัสเข้าสู่แบคทีเรียแต่ไม่เข้าครอบงำเซลล์ ระบบป้องกันจะตัดสารพันธุกรรมออกจากไวรัสและเก็บไว้ในจีโนมของแบคทีเรียเอง DNA ไวรัสในตัวทำหน้าที่เป็นหน่วยความจำทางพันธุกรรม หากไวรัสตัวเดียวกันโจมตีแบคทีเรีย (หรือลูกหลานของแบคทีเรีย) ไวรัสจะจำผู้โจมตีได้อย่างรวดเร็วและสามารถส่งโปรตีน Cas9 เพื่อติดตามได้ การใช้ RNA ของไวรัสเป็น "แผ่นโกง" โปรตีนล่าหา DNA ที่ไม่เป็นมิตรในเซลล์ หากพบว่าตรงกัน ระบบ Crispr-Cas9 จะตัด DNA ของไวรัส ทำให้ไม่สามารถคุกคามได้

ในตอนแรกนักวิทยาศาสตร์คิดว่า Crispr-Cas9 จะแยกชิ้นส่วนของ DNA ออกเท่านั้นหากมันตรงกับแผ่นโกงของ RNA ที่มันมีอยู่ อย่างไรก็ตาม สมมติฐานดังกล่าวได้รับการพิสูจน์แล้วว่าผิด โปรตีนบางครั้งตัดลำดับดีเอ็นเอที่คล้ายกับวัสดุที่กำลังมองหา แต่มีตัวอักษรที่แตกต่างกันจำนวนหนึ่ง นักวิจัย Martin Depken จาก Delft University of Technology ระบุว่า การตัดลำดับที่แตกต่างกันเล็กน้อยนั้นมีเหตุผลอย่างมากจากมุมมองของวิวัฒนาการ "ไวรัสกลายพันธุ์อย่างต่อเนื่อง ดังนั้นจึงสามารถมีองค์ประกอบทางพันธุกรรมที่แตกต่างจากที่ Cas9 กำลังมองหา" เขากล่าว "ด้วยการตัดลำดับดีเอ็นเอที่แตกต่างกันเล็กน้อย ระบบ Crispr-Cas9 สามารถติดตามวิวัฒนาการของไวรัสและปกป้องแบคทีเรียจากศัตรูได้ดียิ่งขึ้น"

แต่ในกรณีนี้ สิ่งที่ดีสำหรับแบคทีเรียนั้นไม่ดีสำหรับมนุษย์ หากเราต้องการใช้ Cas9 เพื่อแก้ไขยีนจาก DNA จำเป็นที่ยีนจะไม่ถูกตัดออกนอกจากยีนที่นักวิจัยตั้งเป้าไว้ การทำลายสารพันธุกรรมอื่นๆ อาจส่งผลร้ายแรง

การทดลองแสดงให้เห็นว่า Crispr-Cas9 มีแนวโน้มที่จะตัดลำดับที่ไม่ตรงกันบางอย่างมากกว่าลำดับอื่นๆ นักวิทยาศาสตร์จากกลุ่มวิจัยของ Martin Depken นำโดย Ph.D. นักเรียน Misha Klein สงสัยว่าฟิสิกส์พื้นฐานที่กำหนดความชอบนี้คืออะไร Depken กล่าวว่าทั้งหมดเกี่ยวกับพลังงานที่ใช้ในการสร้างคู่เบสที่เบี่ยงเบนไปจากเทมเพลต RNA

"เมื่อ Cas9 ตรวจสอบว่าลำดับดีเอ็นเอตรงกันหรือไม่ มันเริ่มต้นที่ปลายด้านหนึ่งของเกลียว" Depken อธิบาย "จากนั้นจะตรวจสอบตัวอักษรทั้งหมดของเกลียว สำหรับแต่ละการแข่งขัน Cas9 จะได้รับรางวัลเป็นพลังงาน ในขณะที่การจับคู่ที่ไม่ตรงกันจะใช้พลังงาน ยิ่งลำดับ DNA มีข้อผิดพลาดมากเท่าใด และยิ่งเข้าใกล้จุดเริ่มต้นของลำดับมากขึ้นเท่านั้น ยิ่งมีแนวโน้มมากขึ้นที่โปรตีนจะละเว้นจากการตัด แทนที่ มันจะเลิกผูกมัดจาก DNA และดำเนินการค้นหาสารพันธุกรรมชิ้นหนึ่งที่ตรงกับแม่แบบ RNA ของมันมากกว่า

ตาม Depken แบบจำลองทางคณิตศาสตร์อย่างง่ายที่พัฒนาโดยกลุ่มของเขาทำนายข้อมูลที่มีอยู่เกี่ยวกับพฤติกรรมการตัดของ Cas9 ได้ดีอย่างน่าประหลาดใจ หากมีข้อผิดพลาดอยู่ที่ส่วนท้ายของลำดับ โปรตีนน่าจะมีพลังงานเพียงพอที่จะเอาชนะอุปสรรคนั้น ซึ่งจะเพิ่มความน่าจะเป็นของการตัด แบบจำลองยังอธิบายด้วยว่าเหตุใด Cas9 ละเว้นจากการตัดเมื่อพบความไม่ตรงกันที่จุดเริ่มต้นของซีเควนซ์ หรือเมื่อสองไม่ตรงกันอยู่ใกล้กัน

เมื่อพูดถึงความน่าจะเป็นที่จะตัดลำดับ DNA คุณสมบัติทางกายภาพของโปรตีน Cas9 ก็มีบทบาทเช่นกัน Depken และเพื่อนร่วมงานของเขากำลังมองหาที่จะรวมตัวแปรนี้เข้ากับโมเดลของพวกเขา ในท้ายที่สุด ตัวแบบควรนำไปสู่การคาดคะเนข้อผิดพลาดที่ Cas9 มีแนวโน้มที่จะทำได้ดีขึ้น "บางครั้ง อาจมีทางเลือกในตำแหน่งที่แน่นอนในการตัดเมื่อทำการแก้ไขยีน และแบบจำลองของเราจะช่วยกำหนดว่าสถานที่ใดดีที่สุดในการกำหนดเป้าหมาย" Depken กล่าว ความเข้าใจทางกายภาพที่ได้จากตัวแบบยังสามารถช่วยให้พยายามหลีกเลี่ยงข้อผิดพลาดที่คุกคามชีวิตขณะแก้ไข DNA


การเตรียมดีเอ็นเอ

การโคลนโมเลกุลเกี่ยวข้องกับการนำดีเอ็นเอเข้าไปแทรกเข้าไปในโมเลกุลเวกเตอร์ DNA ที่จะโคลนสามารถรับได้โดยการตัดมันออกจาก DNA ต้นทางโดยการย่อยด้วยเอ็นไซม์จำกัด โดยการคัดลอกจากโมเลกุลต้นทางโดยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) หรือ Reverse Transcription-PCR (RT-PCR) หรือ โดยการประกอบจากชิ้นดีเอ็นเอสั้น (โอลิโกนิวคลีโอไทด์) วิธีการเหล่านี้ทั้งหมดต้องการให้แหล่งดีเอ็นเอปราศจากสารปนเปื้อนที่อาจยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ (เอนโดนิวคลีเอส, โพลีเมอเรส) ที่เกี่ยวข้องกับการประมวลผลดีเอ็นเอสำหรับการโคลนได้เพียงพอ


การโคลนแบบดั้งเดิมโดยการจำกัดการย่อยเอนโดนิวคลีเอสสามารถใช้ DNA แหล่งที่มาต่างๆ ได้หลายประเภท จีโนมดีเอ็นเอสามารถถูกย่อยด้วยเอ็นไซม์จำกัดและโคลนเข้าไปในไซต์เวกเตอร์ที่เข้ากันได้เพื่อผลิตคลังของส่วนแทรกที่ต่างกัน ทั้งหมดมาจาก DNA ต้นทางเดียวกัน DNA ที่โคลนอยู่แล้วเป็นเวกเตอร์หนึ่งตัวสามารถถ่ายโอน (ย่อยย่อย) ไปยังเวกเตอร์ผู้รับใหม่โดยการตัด DNA ที่มีเอ็นไซม์จำกัดออกและทำการโคลนเข้าไปในตำแหน่งที่สอดคล้องกันของเวกเตอร์ที่สอง การดำเนินการนี้มักเกิดขึ้นเพื่อช่วยให้การแสดงออกของโปรตีนหรือการถอดรหัสอาร์เอ็นเอง่ายขึ้น ตัวอย่างเช่น ซึ่งอาจเป็นไปไม่ได้จากเวกเตอร์ดั้งเดิม

PCR มักถูกใช้เพื่อสร้าง DNA สำหรับการโคลนและบ่อยครั้งที่ตำแหน่งการจำกัดถูกรวมเข้าไว้ในตำแหน่งไพรเมอร์เพื่อให้ DNA ที่ถูกขยายสามารถย่อยและโคลนเข้าไปในตำแหน่งจำกัดที่เข้ากันได้ของเวกเตอร์การโคลนนิ่ง DNA ชนิดใดก็ได้ที่มีลำดับที่ต้องการสามารถใช้เป็นแม่แบบสำหรับ PCR การโคลนนิ่งด้วยเอ็นไซม์การจำกัดที่แตกต่างกันสองแบบทำให้มั่นใจได้ว่าปลายแต่ละโมเลกุลที่ไม่เข้ากันจะถูกสร้างขึ้น ด้วยเหตุนี้จึงป้องกันการวนซ้ำของเวกเตอร์อย่างง่าย และบังคับให้เม็ดมีดถูกโคลนตามทิศทาง นี่อาจมีความสำคัญในการสร้างความมั่นใจว่ากรอบการอ่านที่เปิดกว้างสำหรับการแสดงออกของโปรตีน การปรับเปลี่ยน DNA จะสิ้นสุดลงหลังจากการย่อยแบบจำกัดจะมีประโยชน์ในบางสถานการณ์ ตัวอย่างเช่น ในการโคลนแบบไม่มีทิศทาง โดยที่เอ็นไซม์การจำกัดเดี่ยวถูกใช้ ดีฟอสโฟรีเลชันของดีเอ็นเอเวกเตอร์ที่ถูกย่อยจะป้องกันการวนซ้ำของเวกเตอร์ ดังนั้นจะเพิ่มสัดส่วนของโมเลกุลดีเอ็นเอลูกผสมที่ต้องการ

PCR ถูกใช้มากขึ้นในการเตรียม DNA สำหรับการโคลนนิ่งแอปพลิเคชัน DNA ที่ขยายแล้วสามารถโคลนได้โดยตรง หรือหลังจากการย่อยแบบจำกัดด้วยตำแหน่งการจำกัดที่ออกแบบให้เป็นไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับ PCR อีกทางหนึ่ง DNA ที่ขยายแล้วสามารถใช้ในกลยุทธ์การโคลนแบบไม่มีรอยต่อ เช่น NEBuilder HiFi DNA Assembly หรือในการโคลนนิ่งอิสระของ Ligation โมเลกุลเวกเตอร์สำหรับวิธีการโคลนนิ่งเหล่านี้อาจถูกผลิตโดย PCR DNA ที่ขยายด้วย Taq polymerase มีอะดีโนซีนเดี่ยว (A) ที่ไม่ขึ้นกับเทมเพลตซึ่งเพิ่มที่ปลาย 3&rsquo ซึ่งช่วยให้โคลนเป็นเวกเตอร์ T-tailed เสริมได้ โพลีเมอเรสสำหรับการพิสูจน์อักษรที่มีความเที่ยงตรงสูงไม่ได้เพิ่มเบสเพิ่มเติมที่ทำให้สามารถโคลน DNA ที่ขยายแล้วไปยังไซต์การจำกัดแบบปลายทู่ได้ ขึ้นอยู่กับกลยุทธ์การโคลนนิ่งที่เลือก ปลายของ DNA ที่ขยายสามารถแก้ไขได้โดย A-tailing, blunting หรือเพิ่มหรือลบ 5&rsquo-phosphate group DNA เสริม (cDNA) ที่สร้างขึ้นโดยการถอดรหัสย้อนกลับของ RNA สามารถขยายได้ด้วย PCR ความสามารถในการสังเคราะห์ DNA จากเทมเพลต RNA ช่วยให้สามารถโคลนลำดับที่สอดคล้องกับการถอดรหัสยีน


สถาบันกว้าง

ตอบ: “CRISPR” (ออกเสียงว่า “crisper”) ย่อมาจาก Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ซึ่งเป็นจุดเด่นของระบบป้องกันแบคทีเรียที่เป็นพื้นฐานสำหรับเทคโนโลยีการแก้ไขจีโนม CRISPR-Cas9 ในสาขาวิศวกรรมจีโนม คำว่า "CRISPR" หรือ "CRISPR-Cas9" มักถูกใช้อย่างหลวม ๆ เพื่ออ้างถึงระบบ CRISPR-Cas9 และ -CPF1 ต่างๆ (และอื่น ๆ ) ที่สามารถตั้งโปรแกรมเพื่อกำหนดเป้าหมายรหัสพันธุกรรมที่เฉพาะเจาะจงได้ และเพื่อแก้ไข DNA ในตำแหน่งที่แม่นยำ รวมถึงเพื่อวัตถุประสงค์อื่น เช่น สำหรับเครื่องมือวินิจฉัยใหม่ ด้วยระบบเหล่านี้ นักวิจัยสามารถปรับเปลี่ยนยีนในเซลล์และสิ่งมีชีวิตได้อย่างถาวร และในอนาคตอาจแก้ไขการกลายพันธุ์ที่ตำแหน่งที่แม่นยำในจีโนมมนุษย์ เพื่อรักษาสาเหตุทางพันธุกรรมของโรค ขณะนี้ระบบอื่นๆ พร้อมใช้งานแล้ว เช่น CRISPR-Cas13 ซึ่ง RNA เป้าหมายมีช่องทางอื่นสำหรับการใช้งาน และมีลักษณะเฉพาะที่นำมาใช้สำหรับเครื่องมือวินิจฉัยที่มีความละเอียดอ่อน เช่น SHERLOCK

ถาม: CRISPR มาจากไหน

ตอบ: CRISPR ถูกค้นพบครั้งแรกในอาร์เคีย (และต่อมาในแบคทีเรีย) โดย Francisco Mojica นักวิทยาศาสตร์จากมหาวิทยาลัย Alicante ในสเปน เขาเสนอว่า CRISPRs เป็นส่วนหนึ่งของระบบภูมิคุ้มกันของแบคทีเรีย เพื่อป้องกันไวรัสที่บุกรุก ประกอบด้วยลำดับการทำซ้ำของรหัสพันธุกรรม ถูกขัดจังหวะด้วยลำดับ "ตัวเว้นวรรค" ซึ่งเป็นเศษของรหัสพันธุกรรมจากผู้บุกรุกในอดีต ระบบทำหน้าที่เป็นหน่วยความจำทางพันธุกรรมที่ช่วยให้เซลล์สามารถตรวจจับและทำลายผู้บุกรุก (เรียกว่า "แบคทีเรีย") เมื่อพวกเขากลับมา ทฤษฎีของ Mojica ถูกทดลองในปี 2550 โดยทีมนักวิทยาศาสตร์ที่นำโดย Philippe Horvath

ในเดือนมกราคม พ.ศ. 2556 ห้องปฏิบัติการ Zhang ได้เผยแพร่วิธีแรกในการสร้าง CRISPR เพื่อแก้ไขจีโนมในหนูและเซลล์ของมนุษย์

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับนักวิทยาศาสตร์และทีมงานจำนวนมากที่มีส่วนช่วยในการทำความเข้าใจและการพัฒนาระบบ CRISPR ตั้งแต่การค้นพบครั้งแรกจนถึงการสาธิตการแก้ไขจีโนมโดยใช้ CRISPR ครั้งแรก โปรดไปที่ไทม์ไลน์ CRISPR ของเรา

ถาม: ระบบทำงานอย่างไร

ตอบ: ลำดับ “ตัวเว้นวรรค” ของ CRISPR ถูกคัดลอกเป็นลำดับอาร์เอ็นเอแบบสั้น (“CRISPR RNAs” หรือ “crRNAs”) ที่สามารถนำทางระบบไปยังลำดับที่ตรงกันของ DNA เมื่อพบ DNA เป้าหมาย Cas9 ซึ่งเป็นหนึ่งในเอนไซม์ที่ผลิตโดยระบบ CRISPR จะจับกับ DNA และตัดมัน ปิดยีนเป้าหมาย การใช้ Cas9 เวอร์ชันดัดแปลง นักวิจัยสามารถกระตุ้นการแสดงออกของยีนแทนการตัด DNA เทคนิคเหล่านี้ช่วยให้นักวิจัยศึกษาหน้าที่ของยีนได้

การวิจัยยังชี้ให้เห็นว่า CRISPR-Cas9 สามารถใช้เพื่อกำหนดเป้าหมายและแก้ไข "การพิมพ์ผิด" ในลำดับตัวอักษรสามพันล้านตัวอักษรของจีโนมมนุษย์ในความพยายามที่จะรักษาโรคทางพันธุกรรม


การแสดงภาพการทำงานของระบบ CRISPR ของศิลปิน
ภาพประกอบโดย Stephen Dixon

ถาม: CRISPR-Cas9 เปรียบเทียบกับเครื่องมือแก้ไขจีโนมอื่นๆ อย่างไร

ตอบ: CRISPR-Cas9 ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นทางเลือกที่มีประสิทธิภาพและปรับแต่งได้สำหรับเครื่องมือแก้ไขจีโนมอื่นๆ ที่มีอยู่ เนื่องจากระบบ CRISPR-Cas9 นั้นสามารถตัดสาย DNA ได้ CRISPR จึงไม่จำเป็นต้องจับคู่กับเอ็นไซม์สำหรับแยกตัวเหมือนเครื่องมืออื่นๆ นอกจากนี้ยังสามารถจับคู่กับลำดับ RNA "ไกด์" (gRNA) ที่ออกแบบมาโดยเฉพาะได้อย่างง่ายดาย ซึ่งออกแบบมาเพื่อนำพวกเขาไปสู่เป้าหมายดีเอ็นเอของพวกมัน ลำดับ gRNA ดังกล่าวหลายหมื่นรายการได้ถูกสร้างขึ้นแล้วและพร้อมสำหรับชุมชนการวิจัย CRISPR-Cas9 ยังสามารถใช้เพื่อกำหนดเป้าหมายยีนหลายตัวพร้อมกัน ซึ่งเป็นข้อดีอีกประการหนึ่งที่ทำให้ยีนนี้แตกต่างจากเครื่องมือแก้ไขยีนอื่นๆ

ถาม: CRISPR-Cpf1 แตกต่างจาก CRISPR-Cas9 อย่างไร

CRISPR-Cpf1 มีความแตกต่างในวิธีที่สำคัญหลายประการจาก Cas9 ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดยมีนัยสำคัญสำหรับการวิจัยและการรักษา

อย่างแรก ในรูปแบบธรรมชาติ เอ็นไซม์ตัดดีเอ็นเอ Cas9 ก่อให้เกิดสารเชิงซ้อนที่มีอาร์เอ็นเอขนาดเล็ก 2 ตัว ซึ่งทั้งสองอย่างนี้จำเป็นสำหรับการตัด ระบบ Cpf1 นั้นง่ายกว่าโดยต้องการเพียง RNA เพียงตัวเดียว เอ็นไซม์ Cpf1 นั้นมีขนาดเล็กกว่า SpCas9 มาตรฐาน ทำให้ส่งไปยังเซลล์และเนื้อเยื่อได้ง่ายขึ้น

ประการที่สอง และอาจสำคัญที่สุด Cpf1 ตัด DNA ในลักษณะที่แตกต่างจาก Cas9 เมื่อความซับซ้อนของ Cas9 ตัด DNA มันจะตัดทั้งสองเส้นในที่เดียวกัน ปล่อยให้ "ปลายทู่" ซึ่งมักจะได้รับการกลายพันธุ์เมื่อกลับมารวมกัน ด้วยคอมเพล็กซ์ Cpf1 การตัดในเกลียวทั้งสองเส้นจะถูกชดเชย โดยปล่อยให้มีระยะยื่นสั้นที่ปลายที่โผล่ออกมา ซึ่งคาดว่าจะช่วยให้สอดแทรกได้อย่างแม่นยำ ทำให้นักวิจัยสามารถรวมชิ้นส่วนของ DNA ได้อย่างมีประสิทธิภาพและแม่นยำยิ่งขึ้น

ประการที่สาม Cpf1 ตัดออกจากไซต์การรู้จำ ซึ่งหมายความว่าแม้ว่ายีนเป้าหมายจะกลายเป็นการกลายพันธุ์ที่ไซต์ที่ถูกตัด แต่ก็มีแนวโน้มว่าจะยังคงถูกตัดใหม่ ทำให้มีโอกาสหลายครั้งในการแก้ไขที่ถูกต้อง

ประการที่สี่ ระบบ Cpf1 ให้ความยืดหยุ่นใหม่ในการเลือกไซต์เป้าหมาย เช่นเดียวกับ Cas9 คอมเพล็กซ์ Cpf1 จะต้องแนบกับลำดับแบบสั้นที่เรียกว่า PAM ก่อน และต้องเลือกเป้าหมายที่อยู่ติดกับลำดับ PAM ที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติ คอมเพล็กซ์ Cpf1 รับรู้ลำดับ PAM ที่แตกต่างจาก Cas9 อย่างมาก นี่อาจเป็นข้อได้เปรียบในการกำหนดเป้าหมาย ตัวอย่างเช่น จีโนมปรสิตมาลาเรียและแม้แต่จีโนมมนุษย์

ถาม: CRISPR สามารถใช้ทางวิทยาศาสตร์อื่นใดนอกเหนือจากการแก้ไขจีโนม

ตอบ: การแก้ไขจีโนม CRISPR ช่วยให้นักวิทยาศาสตร์สามารถสร้างแบบจำลองเซลล์และสัตว์ได้อย่างรวดเร็ว ซึ่งนักวิจัยสามารถใช้เพื่อเร่งการวิจัยเกี่ยวกับโรคต่างๆ เช่น มะเร็งและความเจ็บป่วยทางจิต นอกจากนี้ CRISPR กำลังได้รับการพัฒนาเพื่อการวินิจฉัยอย่างรวดเร็ว เพื่อช่วยส่งเสริมการวิจัยประเภทนี้ทั่วโลก Feng Zhang และทีมของเขาได้ฝึกอบรมนักวิจัยหลายพันคนในการใช้เทคโนโลยีการแก้ไขจีโนม CRISPR ผ่านการศึกษาโดยตรงและแบ่งปันส่วนประกอบ CRISPR มากกว่า 40,000 รายการกับห้องปฏิบัติการทางวิชาการทั่วโลก


บรรลุผล: การรวมเป้าหมายของชิ้นส่วนดีเอ็นเอโดยการแก้ไขจีโนม

การแทรก DNA ชิ้นใหญ่แบบกำหนดเป้าหมายเป็นเป้าหมายที่สำคัญของพันธุวิศวกรรม อย่างไรก็ตาม เป้าหมายนี้เข้าใจยาก เนื่องจากวิธีการแบบคลาสสิกสำหรับการซ่อมแซมที่เน้นความคล้ายคลึงกันนั้นไม่มีประสิทธิภาพและมักไม่สามารถทำได้ในหลายระบบ มีการอธิบายความก้าวหน้าล่าสุดไว้ที่นี่ ซึ่งช่วยให้สามารถแทรกจีโนมเฉพาะไซต์ของ DNA ที่ค่อนข้างใหญ่ได้อย่างมีประสิทธิภาพที่ดีขึ้นมาก ด้วยการใช้เส้นทางการซ่อมแซมที่ต้องการในเซลล์ของการต่อปลายที่ไม่เป็นเนื้อเดียวกัน DNA ที่มีขนาดสูงถึงหลาย kb สามารถนำมาใช้ได้อย่างแม่นยำอย่างน่าทึ่งด้วยวิธีการของ HITI และ ObLiGaRe ที่มีประสิทธิภาพสูงถึง 30–40% ความก้าวหน้าล่าสุดที่ใช้การซ่อมแซมที่เน้นความคล้ายคลึงกัน (วิธีการของแขนที่คล้ายคลึงกันสั้นของ PITCh รวมถึง ssODN 2H2OP) ได้เพิ่มประสิทธิภาพสำหรับการแทรกดีเอ็นเออย่างมีนัยสำคัญ มักจะเป็น 40–50% หรือมากกว่านั้นขึ้นอยู่กับวิธีการและความยาวของดีเอ็นเอ สรุปความท้าทายที่เหลืออยู่ของความแม่นยำในการผสานรวมและการแทรกไซต์นอกเป้าหมาย โดยรวมแล้ว ความก้าวหน้าในปัจจุบันเป็นก้าวสำคัญในการแทรก DNA ขนาดใหญ่เข้าไปในจีโนมจากเซลล์และสิ่งมีชีวิตที่หลากหลาย

นี่คือตัวอย่างเนื้อหาการสมัครสมาชิก เข้าถึงผ่านสถาบันของคุณ


การเปิดใช้งานและการปราบปรามของยีนเป้าหมายโดยใช้Cas9

ลักษณะพิเศษอย่างหนึ่งของ Cas9 คือความสามารถในการผูก DNA เป้าหมายโดยไม่ขึ้นกับความสามารถในการ ผ่า ดีเอ็นเอเป้าหมาย กล่าวอีกนัยหนึ่ง Cas9 ที่มีการกลายพันธุ์ที่ขัดขวางการแตกแยกของดีเอ็นเอ (D10A และ H840A สำหรับ SpCas9) ยังคงสามารถจับ DNA เป้าหมายได้ นอกจากนี้ สิ่งที่เรียกว่า nuclease dead Cas9 หรือ “dCas9” สามารถใช้เป็นแพลตฟอร์มในการขนส่งสินค้าที่หลากหลายไปยังตำแหน่ง DNA ที่เฉพาะเจาะจง โดยการหลอมรวมเข้ากับ dCas9 โดยตรง คุณสมบัติของ dCas9 นี้ถูกใช้เพื่อจำกัดขอบเขตของโปรตีนที่หลากหลายเพื่อกำหนดเป้าหมายยีน ซึ่งรวมถึงตัวกระตุ้นการถอดรหัสและตัวยับยั้งการถอดรหัส

ยับยั้งยีนเป้าหมายโดยใช้ตัวยับยั้งแบบ dCas9

การทดลองในช่วงต้นโดยใช้ dCas9 ในแบคทีเรียแสดงให้เห็นว่าการกำหนดเป้าหมาย dCas9 ไปยังไซต์เริ่มต้นการถอดรหัสนั้นเพียงพอที่จะ "ยับยั้ง" หรือ "ล้มลง" โดยการปิดกั้นการเริ่มต้นการถอดรหัส ในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม การกดขี่อย่างรุนแรงจำเป็นต้องมีการกำหนดเป้าหมาย dCas9 ที่ติดแท็กด้วยตัวกดการถอดรหัสไปยังบริเวณโปรโมเตอร์ของยีนที่สนใจ คุณอาจต้องการพิจารณาใช้ตัวยับยั้งแบบ dCas9 ซึ่งรวมถึง dCas9-KRAB เมื่อการขจัดยีนเป้าหมายของคุณเป็นพิษต่อเซลล์ พลาสมิดสำหรับการยับยั้งยีนเป้าหมายในสายพันธุ์และประเภทเซลล์ต่างๆ สามารถพบได้บนเว็บไซต์ของ Addgene

เปิดใช้งานยีนเป้าหมายโดยใช้ตัวกระตุ้นที่ใช้ dCas9

อาร์เรย์ของตัวกระตุ้นที่ใช้ dCas9 นั้นค่อนข้างหลากหลาย ตัวกระตุ้นที่ง่ายที่สุดประกอบด้วย dCas9 ที่หลอมรวมกับโดเมนการเปิดใช้งานการถอดรหัสเดียว (โดยทั่วไปคือ VP64) ตัวกระตุ้นรุ่นที่สองเพิ่งได้รับการพัฒนาและการแสดงออกของยีนเหล่านี้เปลี่ยนแปลงโดยใช้วิธีการที่แตกต่างกันสองสามวิธี ตัวอย่างเช่น ระบบ “SunTag” อำนวยความสะดวกในการจัดหาโดเมนการกระตุ้นหลายโดเมนไปยังตำแหน่งทางพันธุกรรมเดียวกันผ่านการแสดงออกร่วมของอีพิโทปที่แท็ก dCas9 และฟิวชันโปรตีนที่กระตุ้นด้วยแอนติบอดี คอมเพล็กซ์ Synergistic Activation Mediator ประกอบด้วยฟิวชั่น dCas9-VP64 และ gRNA ที่ดัดแปลงซึ่งมีความสามารถในการโต้ตอบกับตัวกระตุ้นการถอดรหัสการถอดรหัสที่มีผลผูกพัน RNA เพิ่มเติม สามารถดูพลาสมิดเพิ่มเติมสำหรับกระตุ้นยีนเป้าหมายในสายพันธุ์และประเภทเซลล์ต่างๆ ได้ในเว็บไซต์ของ Addgene


ตัวเลือกการเข้าถึง

ซื้อบทความเดียว

เข้าถึง PDF บทความฉบับเต็มได้ทันที

การคำนวณภาษีจะสิ้นสุดในขั้นตอนการชำระเงิน

สมัครสมาชิกวารสาร

เข้าถึงปัญหาทั้งหมดทางออนไลน์ได้ทันทีตั้งแต่ปี 2019 การสมัครสมาชิกจะต่ออายุอัตโนมัติทุกปี

การคำนวณภาษีจะสิ้นสุดในขั้นตอนการชำระเงิน


CRISPR เป็นแรงบันดาลใจให้เทคนิคใหม่ในการแก้ไขยีน

RETOOLED ปรับแต่งโปรแกรมแก้ไขยีนล้ำสมัยที่รู้จักกันในชื่อ CRISPR เสริมพลังของมัน

แบ่งปันสิ่งนี้:

นักวิทยาศาสตร์มักอายที่จะใช้คำว่า ความมหัศจรรย์ — เว้นแต่ว่าพวกเขากำลังพูดถึงเครื่องมือแก้ไขยีนที่เรียกว่า CRISPR/Cas9 "คุณสามารถทำอะไรกับ CRISPR" บางคนกล่าว คนอื่นเรียกมันว่าน่าทึ่ง

CRISPR สามารถจัดการกับยีนในพืชหรือสัตว์ได้อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ ในช่วงสี่ปีที่ผ่านมานับตั้งแต่มี CRISPR นักวิจัยได้ใช้มันเพื่อแก้ไขโรคทางพันธุกรรมในสัตว์ ต่อสู้กับไวรัส ฆ่าเชื้อยุง และเตรียมอวัยวะหมูสำหรับการปลูกถ่ายมนุษย์ ผู้เชี่ยวชาญส่วนใหญ่คิดว่านั่นเป็นเพียงจุดเริ่มต้น ความเป็นไปได้อันทรงพลังของ CRISPR - แม้แต่แนวคิดที่ขัดแย้งกันในการสร้าง "เด็กดีไซเนอร์" และการกำจัดทั้งสายพันธุ์ - เป็นสิ่งที่น่าทึ่งและบางครั้งก็น่ากลัว

จนถึงตอนนี้ ผลกระทบที่ใหญ่ที่สุดของ CRISPR นั้นสัมผัสได้ในห้องแล็บชีววิทยาขั้นพื้นฐานทั่วโลก ตัวแก้ไขยีนราคาไม่แพงและใช้งานง่ายทำให้นักวิจัยสามารถเจาะลึกความลึกลับพื้นฐานของชีวิตในรูปแบบที่ยากหรือเป็นไปไม่ได้ นักชีววิทยาด้านพัฒนาการ Robert Reed เปรียบ CRISPR กับเมาส์คอมพิวเตอร์ “คุณสามารถชี้ไปที่ตำแหน่งหนึ่งในจีโนมและคุณสามารถทำทุกอย่างที่คุณต้องการ ณ จุดนั้น”

อะไรก็ได้ ตราบใดที่มันเกี่ยวข้องกับการตัด DNA CRISPR/Cas9 ในชาติกำเนิดดั้งเดิมเป็นอุปกรณ์กลับบ้าน (ส่วน CRISPR) ที่จะนำกรรไกรโมเลกุล (เอนไซม์ Cas9) ไปยังส่วนเป้าหมายของ DNA พวกเขาทำงานร่วมกันเป็นขีปนาวุธล่องเรือที่ดัดแปลงพันธุกรรมที่ปิดใช้งานหรือซ่อมแซมยีนหรือแทรกสิ่งใหม่ ๆ ในที่ที่มันตัด

แม้จะมีความสามารถทางพันธุกรรมทั้งหมดที่ระบบ CRISPR/Cas9 สามารถทำได้ "ยังมีข้อบกพร่องอยู่ มีหลายสิ่งที่เราต้องการที่จะทำให้ดีขึ้น” Feng Zhang นักชีววิทยาระดับโมเลกุลของ MIT กล่าว หนึ่งในนักวิทยาศาสตร์กลุ่มแรกๆ ที่ใช้กรรไกรระดับโมเลกุลกล่าว จากรายงานแรกสุดของเขาในปี 2013 เกี่ยวกับการใช้ CRISPR/Cas9 ในการตัดยีนในเซลล์มนุษย์และเซลล์หนู Zhang ได้อธิบายวิธีที่จะทำให้ระบบทำงานอย่างแม่นยำและมีประสิทธิภาพมากขึ้น

เขาไม่ได้อยู่คนเดียว เอกสารจำนวนมากในช่วงสามปีที่ผ่านมามีการปรับปรุงรายละเอียดสำหรับบรรณาธิการ ยิ่งไปกว่านั้น กลุ่มนักวิทยาศาสตร์ รวมทั้ง Zhang ได้ฝันถึงวิธีที่จะทำให้ CRISPR ทำงานได้อย่างคุ้มค่า

การเปลี่ยน CRISPR ให้เป็น multitasker มักจะเริ่มต้นด้วยการทำให้ความล้ำหน้าของเทคโนโลยีล้ำสมัยแย่ลง ในการดัดแปลงใหม่หลายอย่าง กรรไกร Cas9 ที่ "ตายแล้ว" ไม่สามารถตัด DNA ได้ กรรไกรที่หักอาจฟังดูไร้ประโยชน์ แต่นักวิทยาศาสตร์ได้ปรับปรุงพวกมันให้เป็นจิตรกรโครโมโซม, ตัวแก้ไขการพิมพ์ผิด, เครื่องกระตุ้นการทำงานของยีนและสารยับยั้ง และเครื่องมือซ่อมแซมจีโนมทั่วไป

Gene Yeo นักชีววิทยา RNA แห่งมหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนีย ซานดิเอโกกล่าวว่า “Cas9 ดั้งเดิมนั้นเหมือนกับมีดทหารของสวิสที่มีเพียงแอปพลิเคชั่นเดียว: มันคือมีด” แต่ Yeo และนักวิจัยคนอื่นๆ ได้ยึดโปรตีนและสารเคมีอื่นๆ เข้ากับใบมีดที่ทื่อ และเปลี่ยนมีดให้เป็นเครื่องมืออเนกประสงค์

Zhang และเพื่อนร่วมงานกำลังสำรวจการแลกเปลี่ยนส่วน Cas9 ของระบบสำหรับเอนไซม์อื่น ๆ ที่อาจขยายประเภทของการจัดการที่นักวิทยาศาสตร์สามารถดำเนินการกับ DNA และโมเลกุลอื่น ๆ ด้วยกล่องเครื่องมือที่ขยายออกไป นักวิจัยอาจมีอำนาจในการไขความลับของโรคมะเร็งและโรคอื่นๆ และตอบคำถามใหม่ๆ เกี่ยวกับชีววิทยา

ทำมากขึ้น

CRISPR/Cas9 แบบดั้งเดิมเป็นสิ่งหนึ่ง: กรรไกรเป้าหมาย RNA ไกด์นำทางเอ็นไซม์ Cas9 ไปสู่ ​​DNA ที่เจาะจง จากนั้น Cas9 จะแยก DNA เพื่อปิดการใช้งานหรือซ่อมแซมยีน

อี. ออตเวลล์

ขณะนี้นักวิจัยกำลังขยายสิ่งที่ CRISPR/Cas9 สามารถทำได้โดยการแปลงหัวกัดเป็นแพลตฟอร์มสำหรับเครื่องมือเฉพาะทางจำนวนมาก

อี. ออตเวลล์

Cas9 ที่พิการหรือ "ตาย" สามารถแก้ไขข้อผิดพลาดพื้นฐานเดียวในคำสั่งทางพันธุกรรมของ DNA ด้วยขั้นตอนต่างๆ หลายขั้นตอน เอนไซม์ cytidine deaminase ที่ยึดติดกับ Cas9 ที่ตายแล้วจะเปลี่ยนคู่เบส C-G DNA เป็นคู่เบส TA

อี. ออตเวลล์

การติดแท็กเรืองแสงกับ Cas9 ที่ตายแล้ว นักวิจัยสามารถค้นหาและสังเกต DNA (ซ้าย) หรือ RNA (ขวา) บางส่วนในเซลล์ที่มีชีวิต

อี. ออตเวลล์

Dead Cas9 สามารถปิดกั้น RNA polymerase ไม่ให้เปิดยีน ซึ่งเป็นกระบวนการที่เรียกว่า CRISPRi (สำหรับการรบกวน CRISPR) ใน CRISPRa (การกระตุ้น CRISPR) โปรตีนที่เปิดใช้งานยีนจะถูกหลอมรวมกับ Cas9 ที่ตายแล้ว

อี. ออตเวลล์

โปรตีนตัวดัดแปลง Epigenetic ที่หลอมรวมกับ Cas9 ที่ตายแล้วจะติดแท็กเคมีกับ DNA หรือฮิสโตน (โปรตีนที่บรรจุ DNA) แท็กส่งผลต่อกิจกรรมของยีน แต่อย่าเปลี่ยนคำแนะนำของยีน

คำแนะนำที่ยืดหยุ่น

เอ็นไซม์หลายชนิดสามารถตัด DNA ได้ตั้งแต่แรกพบในปี 1970 และช่วยในการเปิดสาขาทั้งหมดของพันธุวิศวกรรม สิ่งที่ทำให้ CRISPR/Cas9 พิเศษคือความแม่นยำ นักวิทยาศาสตร์สามารถสร้างสไลซ์ผ่าตัดในจุดที่เลือกได้เพียงจุดเดียว เทคโนโลยีการแก้ไขยีนล่าสุดสองสามอย่าง เช่น zinc finger nucleases และ TALENs สามารถล็อกไว้ที่เป้าหมายเดียวได้ แต่ตัวแก้ไขยีนเหล่านั้นเปลี่ยนเส้นทางได้ยาก นักวิทยาศาสตร์ที่ต้องการตัดจุดใหม่ในจีโนมต้องสร้างตัวแก้ไขใหม่ เหมือนกับว่าต้องประกอบขีปนาวุธนำวิถีที่ไม่ซ้ำใครสำหรับทุกเป้าหมายที่เป็นไปได้บนแผนที่ ด้วย CRISPR/Cas9 นั่นไม่จำเป็น

เคล็ดลับของความยืดหยุ่นของ CRISPR คือระบบนำทาง RNA ชิ้นสั้น ๆ เลี้ยงเอนไซม์ตัด Cas9 ไปยังเป้าหมายของ DNA “ไกด์อาร์เอ็นเอ” สามารถกลับบ้านได้ทุกที่ที่นักวิจัยเลือกโดยการจับคู่ทางเคมีกับหน่วยการสร้างหรือฐานที่ประกอบด้วยข้อมูลของ DNA (แสดงด้วยตัวอักษร A, T, C และ G) การทำคู่มือใหม่ RNA เป็นเรื่องง่ายที่นักวิจัยมักจะสั่งซื้อออนไลน์โดยพิมพ์ลำดับเบสที่ต้องการ

ระบบนำทางนั้นกำลังนำวิศวกรพันธุศาสตร์ไปยังสถานที่ที่ไม่เคยไปมาก่อน Reed จาก Cornell University กล่าวว่า "ด้วย CRISPR ในชั่วข้ามคืนสิ่งที่ทำให้หงุดหงิดที่สุดในอาชีพการงานของฉันกลายเป็นโครงการด้านระดับปริญญาตรี" “มันเหลือเชื่อมาก”

CRISPR/Cas9 สามารถดัดแปลงพันธุกรรมของผีเสื้อที่ตัดยีนที่เรียกว่า ไกลน้อย ทำให้เกิดจุดบอด (ขวา) มากกว่าที่ปรากฏบนปีกปกติ (ซ้าย) L. Zhang และ R.D. รีด/การสื่อสารธรรมชาติ 2016

รีดศึกษาวิธีการวาดลวดลายบนปีกผีเสื้อและปีกผีเสื้อ ลวดลายสีเป็นหนึ่งในคำถามพื้นฐานที่นักชีววิทยาด้านวิวัฒนาการและพัฒนาการพยายามหาคำตอบมานานหลายทศวรรษ ในปี 1994 Sean B. Carroll และเพื่อนร่วมงานได้ค้นพบยีนที่เรียกว่า ไกลน้อย ถูกเปิดใช้งานในปีกผีเสื้อในสถานที่ที่จุดตาในภายหลัง ยีนดูเหมือนจะจำเป็นสำหรับการสร้างจุดตา แต่หลักฐานเป็นเพียงสถานการณ์เท่านั้น นั่นคือสิ่งที่นักวิจัยติดอยู่ 20 ปี Reed กล่าว พวกเขาไม่มีทางที่จะจัดการกับยีนในปีกผีเสื้อเพื่อให้ได้รับการพิสูจน์โดยตรงมากขึ้นเกี่ยวกับบทบาทของยีนต่างๆ ในการวาดลวดลายของปีก

ด้วย CRISPR/Cas9 เพื่อนร่วมงานของ Reed และ Cornell Linlin Zhang ได้ตัดและปิดการใช้งาน ไกลน้อย ยีนในช่วงเริ่มต้นของการพัฒนาปีกและได้ผลลัพธ์ที่ไม่คาดคิด: แทนที่จะทำให้เกิดจุดบอด ไกลน้อย จำกัดพวกเขา เมื่อ CRISPR/Cas9 ล้มลง ไกลน้อยนักวิจัยรายงานเมื่อเดือนมิถุนายนปีที่แล้ว การสื่อสารธรรมชาติ. รี้ดและเพื่อนร่วมงานไม่ได้ตัดต่อยีนแค่เพียงตัวเดียว แต่มีผีเสื้ออีก 6 สายพันธุ์โดยใช้ CRISPR เขากล่าว

Marc Tessier-Lavigne นักประสาทวิทยาแห่งมหาวิทยาลัยร็อคกี้เฟลเลอร์ในนิวยอร์กซิตี้กล่าวว่า CRISPR ตัดยีนได้ดีมาก บางทีอาจจะดีเกินไป “เอนไซม์ Cas9 นั้นอุดมสมบูรณ์มาก มันตัดและตัดและตัดใหม่” เขากล่าว การตัดทอนอย่างต่อเนื่องอาจส่งผลให้เกิดการกลายพันธุ์ที่ไม่ต้องการในยีนที่นักวิจัยกำลังแก้ไขหรือในยีนที่พวกเขาไม่เคยตั้งใจจะสัมผัส Tessier-Lavigne และเพื่อนร่วมงานได้ค้นพบวิธีควบคุมเอนไซม์ที่กระตือรือร้นมากเกินไปและป้องกันไม่ให้ยีนของสเต็มเซลล์ของมนุษย์ที่ปลูกในอาหารในห้องปฏิบัติการ ด้วยการควบคุมที่ดีขึ้น นักวิจัยสามารถสร้างการกลายพันธุ์หนึ่งหรือสองครั้งในสองยีนที่เกี่ยวข้องกับโรคอัลไซเมอร์ที่เริ่มมีอาการได้ในวันที่ 5 พฤษภาคม ธรรมชาติ. การเติบโตของเซลล์ต้นกำเนิดที่กลายพันธุ์ในเซลล์สมองแสดงให้เห็นว่าการเพิ่มจำนวนสำเนาของยีนที่กลายพันธุ์ยังช่วยเพิ่มการผลิตเปปไทด์ amyloid-beta ที่สร้างโล่ในสมองที่เป็นโรคอัลไซเมอร์ เทคโนโลยีนี้สามารถทำให้เซลล์ต้นกำเนิดเลียนแบบโรคของมนุษย์ได้ดีขึ้น

บทความต่อไปด้านล่างกราฟิก

การควบคุมบรรณาธิการ

นักวิจัยฝึกเครื่องตัด Cas9 ให้เชื่องเพื่อที่จะตัดยีนหนึ่งหรือทั้งสองสำเนาจากนั้นจึงหยุด ตัด แอป และ PSEN1 ยีนทำให้เกิดการกลายพันธุ์ที่เลียนแบบผู้ที่มีแนวโน้มเป็นโรคอัลไซเมอร์ในระยะเริ่มแรก เซลล์ประสาทสร้างเปปไทด์ที่สร้างคราบจุลินทรีย์ที่ผิดปกติซึ่งมีการกลายพันธุ์สองครั้ง (แถบที่มืดที่สุด) มากกว่าการกลายพันธุ์เพียงครั้งเดียว

อี. ออตเวลล์

ที่มา: D. Paquet et al / ธรรมชาติ 2016

ในขณะที่ Tessier-Lavigne และคนอื่น ๆ กำลังทำงานเพื่อปรับปรุงระบบ CRISPR/Cas9 การสร้าง RNA ที่เป็นแนวทางที่ดีขึ้นและเพิ่มความจำเพาะของการตัด นักวิจัยบางคนหันหลังให้กับ Cas9 ที่ฉลาดแกมโกงทั้งหมด

การแก้ไขที่เหมาะสมยิ่งขึ้น

Cas9 ไม่ได้ถูกตำหนิทั้งหมดสำหรับความยุ่งเหยิงที่เกิดขึ้นเมื่อมันทำให้เกิดการแตกหักแบบสองเกลียวโดยการตัดผ่านรางทั้งสองของบันได DNA David Liu นักชีววิทยาเคมีแห่งมหาวิทยาลัยฮาร์วาร์ดกล่าวว่า "การตอบสนองของเซลล์ต่อการแตกเป็นเกลียวสองเส้นเป็นสาเหตุของปัญหามากมาย วิธีการทั่วไปของเซลล์ในการแก้ไขการละเมิด DNA คือการติดกาวที่ส่วนปลายกลับเข้าหากัน แต่บ่อยครั้งที่ฐานบางส่วนหายไปหรือบิตติดค้างในที่ที่ไม่ได้เป็นของ ผลที่ได้คือ “การทำลายทรัพย์สินมากกว่าการแก้ไข” หลิวกล่าวโดยอ้างคำพูดของจอร์จเชิร์ชเพื่อนร่วมงานของฮาร์วาร์ด

Liu ต้องการตัวแก้ไขยีนที่ไม่ก่อให้เกิดการทำลายล้าง: หนึ่งที่สามารถ A) ไปที่ไซต์เฉพาะในยีนและ B) เปลี่ยนฐาน DNA เฉพาะที่นั่นโดยไม่ต้องตัด DNA ไม่มีเครื่องมือนี้ แต่ใน Cas9 Liu และเพื่อนร่วมงานเห็นการสร้างเครื่องมือดังกล่าว หากพวกเขาปรับแต่งได้เพียงเล็กน้อย

พวกเขาเริ่มต้นด้วยการทำให้ขอบคมของ Cas9 ทื่อและฆ่าเอนไซม์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ Cas9 ที่ “ตายแล้ว” ยังคงสามารถจับ RNA ของไกด์และขี่ไปยังจุดหมายปลายทางได้ แต่มันไม่สามารถผ่าสายคู่ของ DNA ได้ หลิวและเพื่อนร่วมงานได้แนบเอ็นไซม์การโบกรถ ซึ่งมีหน้าที่ในการเริ่มต้นขั้นตอนต่างๆ ในการเปลี่ยน DNA เบส C เป็น T หรือ G เป็น A นักวิจัยต้องแก้ไขระบบด้วยวิธีอื่นเพื่อให้ได้การเปลี่ยนแปลง ที่จะติด. เมื่อพวกเขาแก้ไขข้อบกพร่องแล้ว พวกเขาสามารถทำการเปลี่ยนแปลงคู่เบสคู่อย่างถาวรใน 15 ถึง 75 เปอร์เซ็นต์ของ DNA ที่พวกเขากำหนดเป้าหมายโดยไม่ต้องแนะนำการแทรกและการลบแบบที่การแก้ไข CRISPR แบบดั้งเดิมมักทำ หลิวและผู้ร่วมงานรายงานความสำเร็จใน ธรรมชาติ ในเดือนพฤษภาคม. บรรณาธิการฐานที่คล้ายกันรายงานใน ศาสตร์ ในเดือนสิงหาคมโดยนักวิจัยในญี่ปุ่น อาจมีประโยชน์ในการแก้ไข DNA ในแบคทีเรียและสิ่งมีชีวิตอื่นๆ ที่ไม่สามารถทนต่อการตัด DNA ของพวกมันได้

มีการแลกเปลี่ยนเบสของ DNA ที่เป็นไปได้ 12 แบบ เอนไซม์เดินรถที่หลิวใช้ ไซติดีน ดีอะมิเนส สามารถทำการแลกเปลี่ยนสองครั้งได้ Liu และคนอื่นๆ กำลังทำงานเพื่อหลอมรวมเอ็นไซม์กับ Cas9 ที่สามารถทำอีก 10 ชนิดได้ หลิวกล่าวว่าผู้โบกรถด้วยเอนไซม์อื่น ๆ อาจทำให้สามารถแก้ไขฐาน DNA เดี่ยวได้ตามต้องการ สามารถใช้ตัวแก้ไขพื้นฐานดังกล่าวเพื่อแก้ไขการกลายพันธุ์เดี่ยวที่ทำให้เกิดโรคทางพันธุกรรม เช่น โรคซิสติกไฟโบรซิสหรือกล้ามเนื้อเสื่อม มันอาจจะแก้ไขการกลายพันธุ์ที่นำไปสู่มะเร็งเต้านมที่สืบทอดมา

การเขียนคะแนนใหม่

Dead Cas9 ได้ช่วยนักวิจัยปรับแต่ง DNA ในแบบที่พวกเขาไม่เคยทำมาก่อน การแปรผันของใบมีดทื่ออาจช่วยให้นักวิทยาศาสตร์ไขความลึกลับที่ยิ่งใหญ่อย่างหนึ่งของชีววิทยาได้: ยีนชุดเดียวกันจำนวน 20,000 ยีนก่อให้เกิดเซลล์ต่างๆ ในร่างกายได้อย่างไร

จีโนมเป็นเหมือนเปียโน Jonathan Weissman นักชีวเคมีจากมหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนีย ซานฟรานซิสโกกล่าว “คุณสามารถเล่นเพลงที่หลากหลายได้หลากหลายด้วยคีย์เพียง 88 คีย์ โดยคุณจะกดหนักแค่ไหน คีย์ไหนผสม และจังหวะเวลา” โดยการเรียกเลขหมายหรือเพิ่มกิจกรรมของการรวมกันของยีนในช่วงเวลาที่แม่นยำในระหว่างการพัฒนา เซลล์จะถูกเกลี้ยกล่อมให้กลายเป็นเซลล์ร่างกายหลายร้อยชนิด

ในช่วง 20 ปีที่ผ่านมา นักวิจัยได้เรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับกระบวนการนั้นโดยดูเมื่อยีนบางตัวเปิดและปิดในเซลล์ต่างๆ กิจกรรมของยีนถูกควบคุมโดยโปรตีนหลายชนิดที่ทำให้เวียนหัวที่เรียกว่าปัจจัยการถอดรหัส เมื่อใดและที่ไหนที่ปัจจัยการถอดรหัสทำหน้าที่อย่างน้อยส่วนหนึ่งจะถูกกำหนดโดยแท็กเคมีบน DNA และโปรตีนฮิสโตนที่บรรจุ แท็กเหล่านี้เรียกว่าเครื่องหมาย epigenetic พวกเขาทำงานบางอย่างเช่นโน้ตดนตรีสำหรับวงออเคสตรา โดยบอกปัจจัยการถอดความ "นักดนตรี" ว่าควรเล่นโน้ตใดและควรเล่นเสียงดังหรือเบาเพียงใด จนถึงขณะนี้ นักวิทยาศาสตร์สามารถฟังเพลงได้เท่านั้น ด้วย Cas9 ที่ตายไปแล้ว นักวิจัยสามารถสร้างโมเลกุลที่จะเปลี่ยนโน้ตอีพีเจเนติกได้ทุกที่ในโน้ต Weissman กล่าว ซึ่งช่วยให้นักวิจัยจัดเรียงเพลงของตัวเองได้

เครื่องหมาย Epigenetic เกี่ยวข้องกับการเสพติด โรคมะเร็ง ความเจ็บป่วยทางจิต โรคอ้วน โรคเบาหวาน และโรคหัวใจ Scientists haven’t been able to prove that epigenetic marks are really behind these and other ailments, because they could never go into a cell and change just one mark on one gene to see if it really produced a sour note.

One such epigenetic mark, the attachment of a chemical called an acetyl group to a particular amino acid in a histone protein, is often associated with active genes. But no one could say for sure that the mark was responsible for making those genes active. Charles Gersbach of Duke University and colleagues reported last year in เทคโนโลยีชีวภาพธรรมชาติ that they had fused dead Cas9 to an enzyme that could make that epigenetic mark. When the researchers placed the epigenetic mark on certain genes, activity of those genes shot up, evidence that the mark really does boost gene activity. With such CRISPR epigenetic editors in hand, researchers may eventually be able to correct errant marks to restore harmony and health.

Weissman’s lab group was one of the first to turn dead Cas9 into a conductor of gene activity. Parking dead Cas9 on a gene is enough to nudge down the volume of some genes’ activity by blocking the proteins that copy DNA into RNA, the researchers found. Fusing a protein that silences genes to dead Cas9 led to even better noise-dampening of targeted genes. นักวิจัยรายงานใน เซลล์ in 2014 that they could reduce gene activity by 90 to 99 percent for some genes using the silencer (which Weissman and colleagues call CRISPRi, for interference). A similar tool, created by fusing proteins that turn on, or activate, genes to dead Cas9 (called CRISPRa, for activator) lets researchers crank up the volume of activity from certain genes. In a separate study, published in July in the การดำเนินการของ National Academy of Sciences, Weissman and colleagues used their activation scheme to find new genes that make cancer cells resistant to chemo­therapy drugs.

RNA revolution

New, refitted Cas9s won’t just make manipulating DNA easier. They also could revolutionize RNA biology. There are already multiple molecular tools for grabbing and cutting RNA, Yeo says. So for his purposes, scissors weren’t necessary or even desirable. The homing ability of CRISPR/Cas9 is what Yeo found appealing.

He started simple, by using a tweaked CRISPR/Cas9 to tag RNAs to see where they go in the cell. Luckily, in 2014, Jennifer Doudna at the University of California, Berkeley — one of the researchers who in 2012 introduced CRISPR/Cas9 — and colleagues reported that Cas9 could latch on to messenger RNA molecules, or mRNAs (copies of the protein-building instructions contained in DNA). In a study published in April in เซลล์, Doudna, Yeo and colleagues strapped fluorescent proteins to the back of a dead Cas9 and pointed it toward mRNAs from various genes.

CRISPR attaches fluorescent tags to chromosome endcaps, called telomeres, in a cell’s nucleus (top, green) as well as to centromeres, where chromosomes are pinched together (center, red). Combining images shows where the structures are in relation to each other. S. Wang et al/Scientific Reports 2016

With the glowing Cas9, the researchers tracked mRNAs produced from several different genes in living cells. (Previous methods for pinpointing RNA’s location in a cell killed the cell.) In May, Zhang of MIT and colleagues described a two-color RNA-tracking system in รายงานทางวิทยาศาสตร์. Yet another group of researchers described a CRISPR rainbow for giving DNA a multicolored glow, also in living cells. That glow allowed the team to pinpoint the locations of up to six genes and see how the three-dimensional structure of chromosomes in the nucleus changes over time, the researchers reported in the May เทคโนโลยีชีวภาพธรรมชาติ. A team from UC San Francisco reported in January in การวิจัยกรดนิวคลีอิก that it had tracked multiple genes using combinations of two color tags.

But Yeo wants to do more than watch RNA move around. He envisions bolting a variety of different proteins to Cas9 to manipulate and study the many steps an mRNA goes through between being copied from DNA and having its instructions read to make a protein. Learning more about that multistep process and what other RNAs do in a cell could help researchers understand what goes wrong in some diseases, and maybe learn how to fix the problems.

Zhang wants to improve Cas9, but he would also like other versatile tools. He and colleagues are looking for such tools in bacteria.

CRISPR/Cas9 was first discovered in bacteria as a rudimentary immune system for fighting off viruses (SN: 12/12/15, p. 16). It zeroes in on and then shreds the viral DNA. Researchers most often use the Cas9 cutting enzyme from สเตรปโทคอกคัส pyogenes แบคทีเรีย.

But almost half of all bacteria have CRISPR immune systems, scientists now know, and many use enzymes other than Cas9. In the bacterium Francisella novicida U112, Zhang and colleagues found a gene-editing enzyme, Cpf1, which does things a little differently than Cas9 does. It has a different “cut here” signal that could make it more suitable than Cas9 for cutting DNA in some cases, the team reported last October in เซลล์. Cpf1 can also chop one long guide RNA into multiple guides, so researchers may be able to edit several genes at once. And Cpf1 cuts DNA so that one strand of the DNA is slightly longer than the other. That could make it easier to insert new genes into DNA.

Zhang more recently found an enzyme in the bacterium Leptotricia shahii that could tinker with RNA. The RNA­ cutting enzyme is called C2c2, he and colleagues reported August 5 in ศาสตร์. Like Cas9, C2c2 uses a guide RNA to lead the way, but instead of slicing DNA, it chops RNA.

Zhang’s team is exploring other CRISPR/Cas9-style enzymes that could help them “edit or modulate or interact with a genome more efficiently or more effectively,” he says. “Our search is not done yet.”

The explosion of new ways to use CRISPR hasn’t ended. “The field is advancing so rapidly,” says Zhang. “Just looking at how far we have come in the last three and a half years, I think what we’ll see coming in the next few years will just be amazing.”

This article appears in the September 3, 2016, issue of ข่าววิทยาศาสตร์ with the headline, “CRISPR gets a makeover: The gene-editing tool does one thing well, but that’s just the beginning.”

คำถามหรือความคิดเห็นเกี่ยวกับบทความนี้? ส่งอีเมลถึงเราที่ [email protected]

A version of this article appears in the September 3, 2016 issue of ข่าววิทยาศาสตร์.

การอ้างอิง

H. Yin et al. การแก้ไขจีโนมด้วย Cas9 ในหนูที่โตเต็มวัยจะแก้ไขการกลายพันธุ์และฟีโนไทป์ของโรค เทคโนโลยีชีวภาพธรรมชาติ. ฉบับที่ 32, June 2014, published online March 30, 2014, p. 551. doi:10.1038/nbt.2884.

C. Long et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. ศาสตร์. ฉบับที่ 351, January 22, 2016, published online December 31, 2015, p. 400. doi: 10.1126/science.aad5725.

C. E. Nelson et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. ศาสตร์. ฉบับที่ 351, January 22, 2016, published online December 31, 2015, p. 403. doi: 10.1126/science.aad5143.

M. Tabebordbar et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. ศาสตร์. ฉบับที่ 351, January 22, 2016, published online December 31, 2015, p. 407. doi: 10.1126/science.aad5177.

D. Paquet et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. ธรรมชาติ. ฉบับที่ 533, May 5, 2016, published online April 27, 2016, p. 125. doi:10.1038/nature17664.

D. A. Nelles et al. Programmable RNA tracking in live cells with CRISPR/Cas9. เซลล์. ฉบับที่ 165, April 7, 2016, p. 488. doi: 10.1016/j.cell.2016.02.054.

S. Wang et al. An RNA-aptamer-based two-color CRISPR labeling system. รายงานทางวิทยาศาสตร์. ฉบับที่ 6, May 27, 2016, p. 26857. doi: 10.1038/srep26857.

I. B. Hilton et al. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. เทคโนโลยีชีวภาพธรรมชาติ. ฉบับที่ 33, May 2015, published online April 6, 2015, p. 510. doi:10.1038/nbt.3199.

C. J. Braun et al. Versatile in vivo regulation of tumor phenotypes by dCas9-mediated transcriptional perturbation. การดำเนินการของ National Academy of Sciences. ฉบับที่ 113, July 5, 2016, p. E3892, published online June 20, 2016. doi: 10.1073/pnas.1600582113.

A. C. Komor et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. ธรรมชาติ. ฉบับที่ 533, May 19, 2016, published online April 20, 2016, p. 420. doi:10.1038/nature17946.

H. Ma et al. Multiplexed labeling of genomic loci with dCas9 and engineered sgRNAs using CRISPRainbow. เทคโนโลยีชีวภาพธรรมชาติ. ฉบับที่ 34, May 2016, p. 528, published online April 18, 2016. doi:10.1038/nbt.3526.


Understanding genome editing

Modifying a DNA sequence in a targeted way

Genome editing consists of modifying a cell’s genome with great precision. It is possible to deactivate a gene, introduce a targeted mutation, correct a specific mutation or insert a new gene. This genetic engineering technique uses modified nucleases, known as molecular scissors.

These nucleases cut the DNA at a predefined location in the genome, depending on its sequence. A system of natural DNA repair, known as non-homologous end-joining (NHEJ), is then activated in order to "reattach" the two free extremities generated by the cut. But this system introduces errors, leading to the mutation of the gene targeted by the nuclease. In this case, the mutation introduced is therefore random.

It is also possible to modify the targeted sequence according to one’s requirements. This requires delivering to the cell, in addition to the nucleases, a strand of DNA which presents the desired sequence, flanked by ends which are homologous to those of the site of the cut. Another cellular repair system (homologous recombination) then comes into play, "incorporating" the DNA sequence supplied at the time of the repair, leading to its definitive insertion into the genome.

Base editing: genome editing without DNA cutting

Recently, Cas nucleases have been transformed so that they no longer cut the recognized genome site: the nuclease serves as an anchor point for the transport of other proteins capable of transforming one DNA base into another, thereby inducing a targeted mutation without cutting. This technique, called base editing, could prove to be particularly interesting in cells in which the natural repair processes of DNA breaks are inefficient, rendering traditional genome editing (with double-stranded cutting) ineffective.

These various techniques work in all cell types: human, animal, plant, bacterial, adult or embryonic.

Various types of molecular scissors available

The nucleases used in genome editing are all derived from natural bacterial systems. These so-called restriction enzymes are capable of cutting double-stranded DNA at specific locations. These enzymes are modified in the laboratory in order to recognize and cut the required sequences in the DNA.

Meganucleases

These proteins are extremely specific restriction enzymes, capable of recognizing and cleaving a DNA sequence by assembling themselves in pairs of identical subunits (homodimers). Since their natural repertoire is limited, it is necessary to engineer new meganucleases in order to target a specific site within a genome. As a result, this approach is difficult and reserved for specialists of this system. Their use is very limited.

Zinc-finger nucleases

These artificial proteins are comprised of so-called zinc-finger peptides, which recognize a DNA sequence, and a nuclease (Fok1), which cuts the DNA. Each zinc-finger peptide recognizes a short sequence of three nucleotides and assembling several of these makes it possible to target longer sequences, in a more specific way. Furthermore, in order to cut, zinc-finger nucleases act in pairs on two sites close to each other. This enables the catalytic action of the Fok1 enzymes. Therefore, a genome modification requires two zinc-finger nucleases, whose construction and assembly are very complex. This restricts their use.

Zinc-finger nucleases, based on a figure by Addgene (www.addgene.org)

TALENs

TALENs (transcription activator like-effectors) are also used in pairs, targeting two close DNA sequences. They comprise a DNA binding domain made up of a combination of four peptides, each of these peptides specifically recognizing one of the four bases of the DNA. By acting on the linkage of these peptides, it is possible to target a specific DNA sequence. This binding domain is associated with a Fok1 nuclease which ensures double-strand cutting.

As with zinc-finger nucleases, protein engineering is necessary to construct and assemble the TALENs intended for genome editing. Computer programs such as E-Talen facilitate this task and a library of TALENs capable of recognizing more than 18,700 genes is available. TALENs are easier to produce than zinc-finger nucleases and offer very good efficacy.

TALEN nucleases, based on a figure by Addgene (www.addgene.org)

CRISPR-Cas

This time it is a guide RNA (CRISPR, which stands for clustered regularly interspaced short palindromic repeats) and not a protein which recognizes the target sequence to be cut. It is associated with a Cas nuclease, generally Cas9, which cuts the DNA at this precise location.

Available since 2012, the simplicity of the CRISPR-Cas9 system has revolutionized genome editing. Scientists now use it daily in all areas of research: medicine, agronomy, environment, etc. Producing guide RNA is infinitely easier than producing proteins. It is also a lot faster (requiring a few days as opposed to a few weeks or months for the production of zinc-finger nucleases or TALENs) and a lot less costly.

Barely three months after this tool was developed, several laboratories were already publishing results obtained with this technique, confirming its potential. Five years later, several thousands of research articles - concerning basic or applied research, conducted in countless species, targeting all sorts of applications - had been published.

Use in all domains of life and particularly in biomedical research

Genome editing is used in various domains: agri-food to produce improved species (for example, sheep and veal with increased muscle mass in South America), agronomy (for example, with the genetic modification of invasive plant species, to restrict their growth) and, of course, health. And this is taking place at all levels of research: fundamental, applied and clinical. However, this research is all still very much at the experimental stage.

To produce animal models

Genome editing enables the development of new animal models (sheep, cows, ferrets, rabbits, pigs, etc.) by modifying the genetic heritage of embryos using the CRISPR-Cas9 system before transferring them to the females. In this way, the researchers can have at their disposal unlimited and varied animal models suitable for the study of development, diseases or for use in therapeutic trials.

Two genetically modified macaque monkeys were, for example, born in 2014 following the introduction of mutations in two different genes, one involved in metabolism and the other in immunity. These births have proven that it is possible to obtain genetically modified non-human primates for the study of diseases. Up until then, this type of research was more or less only possible with mice, drosophila and zebrafish.

To produce cell models

In addition to animal models, it is possible to produce tailor made cell culture models. Up until then, the study of rare diseases was notably limited by the difficulty of having homozygous cells for a rare recessive mutation. Now it is possible to create these mutations from healthy cells or to deactivate one of the alleles in heterozygous individuals for this rare mutation.

To treat using gene therapy

By making it possible to introduce a healthy gene or to correct a mutation in the cells of a patient, genome editing paves the way for potential gene therapies. But it faces the same difficulties as the other gene therapy techniques, particularly in regard to the vectorization of the therapeutic DNA and the nucleases (the step which consists of incorporating this material into the cells to be treated).

Several possibilities are available for researchers for an อดีตร่างกาย procedure (the cells to be treated are taken from the patient, modified in the laboratory and then re-administered). The Cas nuclease can be delivered in various forms (DNA, RNA or protein) with the guide RNA, and several delivery methods are possible, such as the application of an electrical field (electroporation) or the use of chemical vectors which increase the permeability of the cell membranes. Nevertheless, the viral vectors remain highly efficient, particularly the lentiviruses and adenoviruses for tests conducted ในร่างกาย.


Regulatory Concepts and Concerns

Although several European authorities proposed ways, how to handle and interpret new plant breeding technologies in the current or an updated European legal framework (e.g., Advisory Committee on Releases to the Environment [ACRE], 2013 Swedish Board of Agriculture [SBA], 2015 Commissie Genetische Modificatie [COGEM], 2017 Federal office for consumer protection and food safety [BVL], 2017) the European court of justice (ECJ) decided fairly unscientifically on July 25th this year, that plant products derived from Genome Editing processes (other than modified by chemical or physical mutagenesis) fall under the strict regulatory framework applied for GMOs (ECLI:EU:C:2018:583) 1 . The judgment triggered strong displeasure in the European scientific community, who forecasts noticeable economic disadvantages for European plant- and seed industry (European Plant Science Organization [EPSO], 2018 European Seed association [ESA], 2018 Vlaamsche Institute Biologie [VIB], 2018). Additionally, also the Scientific advise mechanism of the European commission published a statement on the ruling in which they recall the product-based aspects of the European gene technology law and recommend “revising the existing GMO Directive to reflect current knowledge and scientific evidence, in particular on gene editing and established techniques of genetic modification” (The Scientific Advice Mechanism [SAM], 2018). Due to the ruling European plant breeders need to undergo expensive and time-consuming approval procedures before their products improved by GEENs can be placed on the market. In particular, for DNA-free Genome Editing approaches, this regulation is intangible due to the lacking difference to a conventionally bred plant, as no DNA from non-related crops or organisms is introduced into the plant genome and detectable, neither in the final plant product, nor in its progenies. At no time-point during generation process, the plant genome encounters foreign, recombinant DNA, which usually triggers current European GMO-regulations. The genome edits are usually indistinguishable from natural mutations (Cao et al., 2011). In addition, off-targets play a minor role in DNA-free approaches: compared with stable and transient expression, GEENs are degraded within hours and thus the GEEN’s mode of action is only present in the original cells (protoplasts) of the edited plant (Liang et al., 2015). However, as long Europe sets its focus on the generation process during approval of new plant products, also DNA-free genome edited plants will fall within the same scrutiny as the few legal GMO-plants grown in Europe. This could lead to potential trade issues and impede innovation as stated by members of the WTO lately (World trade organization [WTO], 2018).

Notwithstanding, several countries started to update their legal interpretation of GEEN. Among them are the South-American ABC: Argentina, Brazil, Chile - the United States, Canada and Israel while in Japan and Australia new regulations and a possible exemption of Genome Editing approaches from strict rulings adopted for conventional genetically modified plants are still under discussion. Giving rise to a worldwide regulatory patchwork for genome-edited plants with a diverse set of interpretations and definitions for genome-edited plants resulting in reservations between international trade partners and trade restraints between economic regions. International harmonization of regulations and definitions thus is essential to close the risk-benefit gap between precaution and innovation potential of genome edited plants (Duensing et al., 2018). Argentina pioneered with a straightforward regulation for the new Genome Editing technologies already in 2015, 2 years after the first application of CRISPR in plants. The Resolución 173/2015 2 defines a case-by-case dependent approach, in which applicants can request the responsive authority CONABIA already during product development to determine if their products will fall under GMO regulation. Following the Cartagena protocol definitions for living modified organisms this is only the case when the new plant product contains a -novel- combination of genetic material – similar to conventional transgenic approaches when a transgene is permanently detectable in the final plant product. In case of SDN-1 (NHEJ based deletion/change of a few, often less than 20 nucleotides (Lusser et al., 2011) DNA-free Genome Editing approaches act without introducing foreign DNA that would be detectable in the final plant product. SDN-2 approaches (HDR based replacement of usually less than 20 nucleotides) using a short repair DNA sequence as template, are accordingly not completely DNA-free, although in the final plant product the template is not traceable anymore. In Argentina, plant products derived from GEENs thus will become less strictly regulated than classical GMOs. Likewise, similar guidelines are expectable in Brazil and Chile, which subsequently introduced similar case-by-case, mainly product-focused regulations. Brazil for example interprets GEENs explicitly as SDN as one of several “new precision breeding innovation technologies,” which may create a product not considered a GMO in the annex I of the normative resolution no. 16/2018 3 . Recently, together with the former mentioned ABC, also Paraguay and Uruguay declared their intention to harmonize their Genome Editing-friendly regulations and to establish genome-edited plants analogous to conventionally bred plants 4 . This initiative will transform South America into a hot spot for further Genome Editing innovations. Plant products derived by GEENs still lack on the market in these countries, but it is commendable that more and more countries worldwide clarify their legal status to pave the way for the next green revolution.